冠心寧片對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究

胡 飛，戎亦驪，朱科燕，陸 紅，陳 誠，陳民利，潘永明*

(1. 浙江中醫藥大學比較醫學研究所，杭州 310053；2. 浙江省醫療器械檢驗院，杭州 310018)

研究報告

冠心寧片對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究

胡 飛1,2，戎亦驪1，朱科燕1，陸 紅1，陳 誠1，陳民利1，潘永明1*

(1. 浙江中醫藥大學比較醫學研究所，杭州 310053；2. 浙江省醫療器械檢驗院，杭州 310018)

目的 觀察冠心寧片(GXNT)對心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)大鼠心肌梗死和心臟自主神經功能的影響。方法 SD大鼠70只，隨機分為7組，即偽手術組、MI/RI組、GXNT 75 mg/kg，150 mg/kg，300 mg/kg，600 mg/kg劑量組和300 mg/kg 復方丹參片(DST)組，每組10只。所有大鼠均預防性經口灌胃給藥7 d后，采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支法，建立MI/RI大鼠模型。期間記錄大鼠心電圖并分析心電圖J點和心率變異性(HRV)指標，并用伊文思藍(EB)和2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍(TTC)雙重染色心肌并分析心肌梗死面積以及行HE染色觀察心肌病理學改變，測定血漿乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)水平。結果 與MI/RI組比，冠心寧片組和復方丹參片組能明顯減輕心肌梗死面積和抑制LDH和CK活性的升高(P< 0.05,P< 0.01)，并能降低再灌注期大鼠-J值和J點平均值(P< 0.05，P< 0.01)，顯著提高HRV和血漿NO水平以及降低血漿MDA含量(P< 0.05，P< 0.01)，并能改善心肌組織病理。

結論 冠心寧片能減輕MI/RI大鼠心肌梗死，并能改善心臟自主神經功能。

冠心寧片；心肌缺血再灌注損傷；心臟自主神經功能；心肌梗死；大鼠

缺血性心肌病是導致全球死亡或致殘的主要原因，尤其急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)[1]。恢復缺血心肌的血流是AMI最有效的臨床治療原則，這種治療方式包括溶栓和血管成形術等。然而，發現缺血心肌的突然再灌注會加重心肌組織損傷，這種現象被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)，使得心室收縮功能障礙、心肌細胞損傷和心力衰竭，甚至誘發室性心律失常或心源性猝死[2]。MI/RI的發病機制十分復雜，還尚未完全闡明。已有研究表明，活性氧、鈣超載、中性粒細胞浸潤和細胞凋亡均參與MI/RI的發生。但近來發現AMI患者存在交感/副交感神經功能失調，心臟自主神經功能紊亂，主要表現為心臟迷走神經張力降低，交感神經張力增加，導致心率變異性(heart rate variability, HRV)降低，使得AMI患者發生惡性心律失常和心源性猝死的危險性增加[3]。可見，異常HRV與MI/RI誘發的心血管事件有一定的關聯性。

冠心寧片(guanxinning tablets, GXNT)是由丹參和川芎兩味中藥經改進提取工藝而制成，被用于治療冠心病和缺血性心肌病。本課題組前期研究表明，冠心寧片能提高AMI犬血清一氧化氮(NO)水平和擴張冠脈流量，改善血液粘滯性和血管內皮功能，并具有溶栓作用[4-6]。然而，冠心寧片對MI/RI后心肌梗死和心臟自主神經調控的影響均未見相關報道。為此，本研究基于MI/RI大鼠模型，觀察冠心寧片對MI/RI大鼠心肌梗死和心臟自主神經功能影響，為冠心寧片用于治療臨床AMI提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠70只，體重100～120 g，5～6周齡。由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[SCXK (滬) 2012-0002]，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心[SYXK (浙) 2013-0184]，室溫為21～22℃，相對濕度為40%～70%，飼喂全價營養顆粒飼料，自由飲水，按實驗動物使用的“3R”原則予以人道主義關懷。

1.2 主要儀器及藥物

冠心寧片(guanxinning tablet, GXNT)，橘黃色薄膜片劑，由正大青春寶藥業有限公司研制，批號：160704；復方丹參片(compound danshen tablet，DST)，廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：L5A003；紅四氮唑(TTC)，中國華東師范大學化工廠；伊文思藍，國藥集團化學試劑有限公司；肌酸激酶(CK)，中生北控生物科技股份有限公司生產；乳酸脫氫酶(LDH)，上海申能德賽診斷技術有限公司生產；丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產。7020全自動生化分析儀，日本日立公司；RM2245型徠卡石蠟切片機，美國徠卡公司；DU-800紫外/可見分光光度計，美國Beckman Coulter公司；LC-V9動物呼吸機，上海奧爾科特生物科技有限公司；無創生理信號遙測處理系統，法國EMKA公司。

1.3 分組與給藥

所有大鼠適應性飼養2周后，按體重隨機分為偽手術(Sham)組、心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)組，冠心寧片75、150、300、600 mg/kg劑量組，300 mg/kg復方丹參片組，每組10只。除偽手術和MI/RI組大鼠經口灌胃蒸餾水外，其余大鼠均連續7 d預防性給予相應的藥物，給藥體積為10 mL/kg。

1.4 實驗方法

1.4.1 MI/RI大鼠模型的制備

圖1 實驗操作程序Fig.1 Schematic illustration depicting the experimental protocol

給藥7 d末，各組大鼠術前禁食12 h并稱重，麻醉前15 min經口灌胃給予相應的藥物或溶劑，15 min后以3%戊巴比妥鈉溶液(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，用針形電極刺入四肢皮下，經EMKA無創生理信號遙測處理系統記錄大鼠II導聯心電圖，然后行頸部正中切口，分離氣管并插管，接ALC-V9呼吸機通氣，頻率為60次/min，呼吸比率為2∶1，潮氣量為30 mL/kg。于胸骨左側第4肋間切口，打開胸腔并暴露心臟，于左心耳與肺動脈圓錐之間的左冠狀動脈(LAD)起始下方2～3 mm處，用6-0醫用無損傷帶線縫合針于左心耳下方進針，然后將縫合線穿于自制的冠脈阻斷塑料管。偽手術組縫合線空置、不拉緊縫合線外，其它各組均在灌胃給藥30 min時拉緊縫合線，以塑料管球端壓迫結扎LAD 30 min，松結扎線，再灌注觀察2 h(圖1)。

1.4.2 心電圖檢測和HRV分析

分別記錄各組II導聯心電圖，用ECG-AUTO 自動分析軟件進行模塊化分析大鼠心電圖J點，統計再灌注期J點總和(-J)和平均值(Average of J point)；然后按文獻[7]行HRV分析，時域指標包括RR間期的標準差(SDNN)、相鄰RR間期差值平方和的均方根(RMSSD)，并設定每組數據為512個，重復樣本時間為100 ms，行Hamming快速功率譜分析，獲取極低頻波譜VLF(0.003～0.20 Hz)、低頻波譜LF(0.20～0.75 Hz)、高頻波譜HF(0.75～3.0 Hz)和總功率(TP)，進行標準化計算LFnu、HFnu和平衡指數LF/HF比值。

1.4.3 血液生化指標和心肌梗死面積測定

再灌注損傷2 h后，取腹腔靜脈血3 mL，用肝素抗凝后分離血漿，在日立7020全自動生化分析儀上測定血漿CK和LDH活性，并在DU-800紫外/可見分光光度計上測定血漿MDA和NO水平。取血結束后，向大鼠右心室注射5%伊文思藍1 mL；待鞏膜藍染后從右心室注射10%氯化鉀溶液使心臟驟停，取出心臟并置入2%瓊脂糖PBS緩沖液2 min后，剔除右心室和左右心耳，并放入-20℃中冷凍20 min，然后每隔2 mm橫斷切成5片，置入1% TTC溶液中37℃孵育15 min。用數碼掃描儀掃描心肌片，用Image-J圖像分析軟件分析非TTC染色的灰白色梗死區(INF)占TTC紅染的危險區(AAR)的百分比，其中伊文思藍染區域為非缺血區。

1.4.4 心肌組織病理學觀察

取結扎線下的第2片心肌片置于10%福爾馬林溶液中固定脫水，石蠟包埋，切片，常規HE染色，樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理形態學變化。

1.5 統計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準誤(±s)表示，多組間比較經ANOVA單因素方差分析，組間比較采用L-S-D檢驗，以P< 0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 冠心寧片對MI/RI大鼠心肌損傷的影響

與偽手術組比，MI/RI組INF/AAR比值、血漿LDH和CK活性均顯著升高(P< 0.01)；與MI/RI組比，冠心寧片各劑量組和復方丹參片組能顯著降低INF/AAR比值和血漿CK活性(P< 0.05，P< 0.01)；同時300、600 mg/kg冠心寧片組和復方丹參片組亦能明顯降低血漿LDH活性(P< 0.05，P< 0.01)(圖2)。

2.2 冠心寧片對MI/RI大鼠心電圖J點的影響

與偽手術組比，MI/RI大鼠缺血期J點明顯抬高，再灌注后J點雖有降低但仍高于偽手術組(P< 0.05，P< 0.01)。與MI/RI組比，冠心寧片各劑量組和復方丹參片組能不同程度地抑制缺血期和再灌注期J點的抬高；其中300、600 mg/kg冠心寧片組和復方丹參片組能顯著降低再灌注期-J和J點平均值(P< 0.05，P< 0.01)(圖3)。

注：心肌片經伊文思藍-TTC雙重染色(A)和INF/AAR比值(B)；血漿LDH活性(C)和CK活性(D)；與偽手術組比，ΔΔP < 0.01；與MI/RI組比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖2 冠心寧片對MI/RI大鼠心肌損傷的影響Note.Representative photomicrographs of heart sections stained by Evans blue and TTC in different treatment groups (A) and myocardial infarct size (INF) expressed as a percentage of the total ischemic-reperfused area-at-risk (AAR) (B); the activity of LDH (C) and CK (D) in the serum of rats subjected to MI/RI. ΔΔP < 0.01 vs sham group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group.Fig.2 Effect of GXNT on myocardial damage in MI/RI rats

注：不同時間點的J點(A)，再灌注期總J點(B)和J點平均值(C)；與偽手術組比，ΔΔP < 0.01；與MI/RI組比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖3 冠心寧片對MI/RI大鼠心電圖J點的影響Note.J point at different time (A), -J (B) and average of J point (C) during reperfusion in rats subjected to MI/RI; ΔΔP < 0.01 vs sham group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group. Fig.3 Effects of GXNT on J point of electrocardiogram in MI/RI rats

注：偽手術組(A);MI/RI組(B);300 mg/kg復方丹參片組(C)和600 mg/kg冠心寧片組(D)的心率變異性功率譜分析圖，LF為低頻，HF為高頻。圖4 各組大鼠心率變異性功率譜分析圖Note.Representative spectra of heart rate variability, in the frequency domain, from sham (A), MI/RI (B) and MI/RI rats treated with 300 mg/kg DST (C) or 600 mg/kg GXNT (D). LF, low frequency; HF, high frequency.Fig.4 Power spectra analysis of heart rate variability in each group

注：與偽手術組比，ΔΔP < 0.01；與MI/RI組比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖5 冠心寧片對MI/RI大鼠HRV的影響Note.ΔΔP < 0.01 vs sham group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group.Fig.5 Effect of GXNT on HRV in MI/RI rats

2.3 冠心寧片對MI/RI大鼠心率變異性的影響

與偽手術組比，MI/RI大鼠RR間期、SDNN、RMSSD、TP和HFnu均顯著降低(P< 0.01)，LFnu和LF/HF比值明顯升高(P< 0.01)；與MI/RI組比，復方丹參片組能明顯升高HFnu和降低LF/HF比值(P< 0.05)，同時150、300和600 mg/kg冠心寧片組亦能顯著升高SDNN、RMSSD、TP和HFnu(P< 0.05，P< 0.01)，降低LFnu和LF/HF比值(P< 0.05，P< 0.01)(圖4和圖5)。

2.4 冠心寧片對MI/RI大鼠血漿MDA含量和NO活性的影響

與偽手術組比，MI/RI大鼠血漿MDA含量明顯升高(P< 0.05)，血漿NO活性則顯著降低(P< 0.05)；與MI/RI組比，300、600 mg/kg冠心寧片組和復方丹參片組能顯著降低血漿MDA含量和升高NO活性(P< 0.05，P< 0.01)(圖6)。

注：血漿MDA含量(A)和NO活性(B)；與偽手術組比，ΔP < 0.05；與MI/RI組比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖6 冠心寧片對MI/RI大鼠血漿MDA含量和NO活性的影響Note.MDA content (A) and NO level (B) in the serum of rats subjected to MI/RI. ΔP < 0.05 vs sham group; *P< 0.05, **P < 0.01 vs MI/RI group.Fig.6 Effect of GXNT on serum MDA content and NO activity in MI/RI rats

2.5 心肌組織病理形態學變化

偽手術組心肌纖維排列整齊，細胞核正常，心肌間質無炎性細胞浸潤；MI/RI組心肌纖維腫脹、紊亂、呈波浪樣改變、部分心肌纖維斷裂、細胞核有破裂、溶解消失現象，心肌間質有炎性細胞浸潤，并可見局灶性壞死和出血；75、150 mg/kg冠心寧片組和復方丹參片組心肌纖維破壞雖有所減輕、但仍有腫脹、紊亂以及少量炎性細胞浸潤，偶見局灶性出血；300、600 mg/kg冠心寧片組心肌纖維排列較為整齊，心肌間纖維輕度腫脹、細胞核大小均勻，有少量炎性細胞浸潤(圖7)。

注：(A)偽手術組；(B)MI/RI組；(C)300 mg/kg DST組；(D)75 mg/kg GXNT組；(E)150 mg/kg GXNT組；(F)300 mg/kg GXNT組；(G)600 mg/kg GXNT組。圖7 各組心肌組織病理形態學觀察(×200)Note. (A)Sham group；(B)MI/RI group；(C)300 mg/kg DST group；(D) 75 mg/kg GXNT treated group；(E)150mg/kg GXNT treated group；(F) 300 mg/kg GXNT treated group；(G)600 mg/kg GXNT treated group.Fig.7 Myocardial pathological morphological observation in each group

3 討論

MI/RI的發生，可加重缺血心肌的損傷，甚至可引發AMI患者惡性心律失常和心源性猝死等嚴重后果，為了使AMI患者獲得最大的益處，世界各國研究學者正在積極探索在MI/RI早期干預，從而預防或減輕MI/RI。近幾十年來，傳統中藥在防治心腦血管疾病中已體現出較大的優勢，如中藥丹參、川芎等均被證實對MI/RI有一定的保護作用，并與抗炎、拮抗鈣超載、抑制自由基反應和抗細胞凋亡等有關[8,9]。同樣，本研究也證實經丹參和川芎提取工藝改進而制成的新制劑——冠心寧片也能明顯減輕心肌梗死和抑制血漿心肌酶CK和LDH活性的釋放，表明冠心寧片對MI/RI大鼠心肌損傷具有保護作用，這與冠心寧片對AMI犬的心肌保護作用較為一致[10]，提示冠心寧片可用于防治MI/RI的發生。

另外，MI/RI后發生的室性心律失常是AMI患者心源性猝死的主要原因，故一方面改善心肌的動作電位和興奮性，另一方面有效平衡心臟自主神經調控功能，是影響MI/RI后心肌組織重構和電重構的關鍵環節，這也對防止室性心律失常發生具有十分重要的作用。HRV作為目前無創、敏感、并能客觀評估心臟自主神經活動的一項可靠性指標，已被廣泛用于預測心源性猝死或心血管事件的發生[11]。在本研究中發現MI/RI大鼠心電圖J點出現明顯升高，同時RR間期、SDNN、RMSSD和HFnu均出現明顯降低，而LFnu和LF/HF比值則顯著升高，提示MI/RI發生后出現HRV降低，這可能與心肌缺血或再灌注時期存在過度的交感神經興奮有關，促進心肌組織重構和電重構，進而使得心室電的不穩定性和易感性增強，是導致心律失常發生率增加的主要因素。同時，本研究發現冠心寧片干預后能明顯提高MI/RI大鼠的HRV，并能抑制MI/RI大鼠心電圖J點的抬高，表明冠心寧片能抑制交感神經活性，改善MI/RI大鼠的心肌動作電位和興奮性，有效糾正心臟自主神經調控功能的紊亂，從而改善心室電的穩定性和左心功能，防止心律失常的發生。

研究發現，氧化應激也可造成心肌細胞損傷，增加心肌細胞膜通透性而導致細胞水腫，同時也能影響細胞膜蛋白功能，使細胞膜離子交換出現受阻，引起細胞內鈣超載，加速細胞凋亡或死亡，促進MI/RI發生[12,13]。MDA是心肌細胞內脂質過氧化反應重要的代謝產物，其含量的高低可反映其脂質過氧化和心肌損傷程度[14]；另外也有學者發現NO能對抗心肌細胞凋亡，對MI/RI也具有心肌保護作用[15]。在本研究中也發現MI/RI大鼠血漿MDA明顯升高和NO活性顯著降低，病理組織亦顯示心肌纖維呈波浪樣改變和腫脹，心肌間質有炎性細胞浸潤，并可見局灶性壞死和出血，表明MI/RI大鼠自身存在明顯的氧化應激狀態和炎癥反應；而給予冠心寧片后能明顯降低血漿MDA含量和升高NO活性，并能改善MI/RI大鼠的心肌病理組織形態，進一步證實了冠心寧片具有抗脂質過氧化的作用，并能促進機體NO的釋放，這也可能是冠心寧片保護MI/RI大鼠心肌損傷的作用機制之一。

綜上所述，冠心寧片對MI/RI大鼠心肌損傷具有保護作用，其機制與擴張血管、降低心肌耗氧量，改善心肌缺血，抑制氧化應激反應[10]，保護MI/RI所致的心臟自主神經功能紊亂，提高HRV，從而減少惡性心律失常有關。

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Study on the protective effect of Guanxinning Tablet on myocardial ischemia reperfusion injury in rats

HU Fei1,2, RONG Yi-li1, ZHU Ke-yan1, LU Hong1, CHEN Cheng1, CHEN Min-li1, PAN Yong-ming1*

(1. Institute of Comparative Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2 Zhejiang Institute for the Control of Madical Device, Hangzhou 310018)

Objective To observe the effect of Guanxinning Tablet (GXNT) on myocardial infarction and cardiac autonomic nervous function in rats with myocardial ischemia reperfusion injury (MI/RI). Methods Seventy SD rats were divided into 7 groups randomly (n=10); the sham group, the MI/RI group, 75 mg/kg, 150 mg/kg, 300 mg/kg and 600 mg/kg GXNT groups and 300 mg/kg Compound Danshen Tablets (DST) group. All rats were administered orally for 7 days, and then the MI/RI model was made by ligating the left anterior descending branch of coronary artery in rats. The changes of electrocardiogram were recorded and the electrocardiogram of J points and heart rate variability (HRV) parameters were analyzed. At the end of reperfusion, the myocardial infarct size was measured by using Evans blue and tetrazolium chloride (TTC) double staining, and pathological changes of myocardium were observed by HE staining. The changes of serum lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) levels were also detected. Results Compared with MI/RI group, GXNT and DST groups were significantly reduced myocardial infarct size and inhibited the rising of serum LDH and CK activities (P< 0.05,P< 0.01), and also reduced the total or average value of J point during reperfusion (P< 0.05,P< 0.01). Meanwhile, GXNT and DST groups were markedly increased HRV and serum NO level as well as decreased serum MDA content (P< 0.05,P< 0.01), and improved myocardial tissue pathology. Conclusions GXNT can reduce the myocardial infarction in rats with MI/RI, and also improve the cardiac autonomic nervous function.

Guanxinning Tablet; Myocardial ischemia reperfusion injury; Cardiac autonomic nervous function; Myocardial infarction; Rats

浙江中醫藥大學比較醫學創新團隊(XTD201301)。

胡飛(1988-)，男，碩士生，專業：藥理學。E-mail: 335040880@qq.com

潘永明(1979-)，男，副研究員，研究方向：實驗動物與比較醫學。E-mail:pym918@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0076-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.017

2016-09-27