紫杉醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠CD28、CTLA-4表達及BAFF的影響

張淑江，李作孝

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

研究報告

紫杉醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠CD28、CTLA-4表達及BAFF的影響

張淑江，李作孝*

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

目的 探討紫杉醇對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmunencephalomyelitis，EAE)大鼠腦組織中CD28、CTLA-4表達及脾組織上清液中B細胞刺激因子(BAFF)含量及其意義。方法 按隨機數(shù)字法將50只Wistar大鼠分為5組：紫杉醇(PTX)小、中、大3個劑量組(PTX劑量分別為1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg)、正常對照組，EAE對照組,每組10只。用豚鼠脊髓制成GPSCH并與CFA等體積混合制成免疫抗原，注入大鼠雙足側(cè)足墊(2 mL/kg)進行EAE造模，自造模后，PTX各劑量組腹腔注射紫杉醇，連續(xù)10 d。正常對照組及EAE對照組均給予腹腔注射0.9%NaCl 2 mL。采用腦組織學評分評估實驗大鼠腦組織炎癥浸潤情況，取大鼠腦組織采用流式細胞儀測定腦組織CD28、CTLA-4含量，取脾組織并制成上清液，采用ELISA測定脾組織中BAFF含量。結(jié)果 PTX各劑量組腦組織評分均低于EAE對照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)；PTX各劑量組大鼠腦組織中CD28表達均低于EAE對照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)；CTLA-4表達均高于EAE對照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)；脾組織上清液中BAFF含量均低于EAE對照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)。結(jié)論 PTX可降低EAE大鼠神經(jīng)功能障礙評分，其機制可能涉及調(diào)節(jié)大鼠腦組織中CD28、CTLA-4的表達及脾組織上清液中BAFF含量，從而發(fā)揮對EAE的防治作用。

紫杉醇；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；CD28；CTLA-4；B細胞刺激因子

實驗性自身免疫性腦脊髓炎是多發(fā)性硬化(multipie sclerosis，MS)的理想動物模型，臨床上使用的藥物對MS都療效欠佳，且不能發(fā)揮防治作用，故探討新的治療藥物顯得尤其必要，紫杉醇(Paclitaxel，PTX)在臨床上用于各種惡性腫瘤的化療，且價格低廉。其作用機制可能與調(diào)節(jié)免疫細胞含量及相關(guān)細胞因子含量有關(guān)，而MS屬于自身免疫性疾病，免疫系統(tǒng)功能的紊亂在此病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]，國外已有數(shù)位學者將PTX用于EAE大鼠的研究。比如Frequin等[2]研究發(fā)現(xiàn)PTX通過其抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能對EAE大鼠發(fā)揮著防治作用，其可降低EAE大鼠的發(fā)病率，延長EAE大鼠發(fā)病的潛伏期，縮短EAE大鼠疾病的進展期，改善EAE大鼠臨床癥狀，降低神經(jīng)功能障礙評分。本試驗采用wistar大鼠建立EAE模型，應(yīng)用不同劑量的PTX進行干預，觀察PTX對大鼠發(fā)病情況腦組織病理改變的影響，并測定腦組織中CD28、CTLA-4表達水平及脾組織上清液中B細胞刺激因子含量(B lymphocyte stimulator, BAFF)，從而探討其對EAE及MS的防治作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性Wistar大鼠50只,6周齡，體重(210～230) g，成年8周齡雌性豚鼠5只，體重(350～400)g,所有動物均為清潔級，均購自四川大學華西實驗動物中心[SCXK(川)2013-026]，實驗均在西南醫(yī)科大學中心實驗室完成[SYXK(川)2013-185]。將Wistar大鼠及豚鼠分開飼養(yǎng)(普通環(huán)境)，保持飼養(yǎng)條件恒溫、恒濕，定時定量給予飼料、水，并定期更換墊料，保持生存環(huán)境清潔，1周后觀察大鼠及豚鼠活動情況，死亡及活動度差的大鼠予以剔除，并及時補足同等數(shù)量大鼠及豚鼠。

1.2 主要試劑和藥物

紫杉醇注射液(哈藥集團生物工程有限公司，5 mL/支),CFA(美國Chondrex公司);BCG凍干粉：每支60 mg (上海生物制品研究所),PE標記的小鼠抗大鼠CD28和CD152抗體及相應(yīng)熒光素標記的小鼠IgG1抗體(美國Caltag實驗室), BAFF酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PBS緩沖液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；淋巴細胞分離液，稱量瓶、顯微鏡、一次性流式管、顯微鏡、流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗原制作及動物模型建立

參照Hoehlig K等[3]制作EAE模型的方法進行造模，用豚鼠脊髓制成GPSCH并與CFA等體積混合制成免疫抗原，注入大鼠雙足側(cè)足墊(2 mL/kg)進行EAE造模；正常對照組大鼠于相同部位注射等量CFA，所有動物均在同等條件下飼養(yǎng)。

1.3.2 實驗動物的分組及干預處理

將50只Wistar大鼠隨機分為5組：PTX小、中、大劑量組,正常對照組,EAE對照組,PTX小、中、大劑量組腹腔注射PTX劑量分別為1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg，連續(xù)10 d。正常對照組及EAE對照組均給予腹腔注射0.9% NS 2 mL，所有動物均在同等條件下飼養(yǎng)，均在1月后抽取血清，處死并取腦組織。

1.3.3 腦組織學評分

腦組織學評分標準如下[4]：0分，無炎癥改變；1分，浸潤的炎性細胞限于血管周和腦脊膜周圍；2分，炎性細胞腦實質(zhì)內(nèi)輕度浸潤，1～20個/片；3分，炎性細胞腦實質(zhì)內(nèi)中等程度浸潤，21～100個/片；4分，腦實質(zhì)內(nèi)浸潤的炎細胞達100個/片以上。每張切片隨機選取5個視野計數(shù)后取均值，每只大鼠取2張切片作計數(shù)，將2張切片計數(shù)后的平均值作為該只大鼠的評分結(jié)果。

1.3.4 腦組織CD28、CTLA-4測定

用PBS緩沖液去除大鼠的延髓組織血跡，使用研磨器將延髓組織制成勻漿，以3000 r/min離心15 min后取上清液，采用流式細胞儀測定腦組織CD28、CTLA-4含量。

1.3.5 脾組織上清液BAFF含量測定

無菌取出脾臟后，剪碎脾組織，并用玻璃注射器針芯進行研磨，后用無菌生理鹽水進行沖洗，經(jīng)銅網(wǎng)進行過濾以除去結(jié)締組織被膜，然后將脾細胞懸液收集于無菌細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，取與脾細胞懸液等體積的淋巴細胞分離液加入至離心管，將脾細胞懸液慢加入至淋巴細胞分離液上；室溫300 g離心20 min，吸取單個核細胞層，轉(zhuǎn)入至新的離心管中，加入緩沖液，300 g離心10 min，棄上清后，再洗滌一次；棄上清，用細胞培養(yǎng)液重懸，臺盼藍染色計數(shù)活細胞率大于95%，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL。采用ELISA法測定BAFF含量,具體操作步驟按試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠的表現(xiàn)及相關(guān)評分

EAE大鼠造模成功表現(xiàn)：早期表現(xiàn)為活動及進食量減少、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、體重下降，后期出現(xiàn)抬尾無力、后肢無力，嚴重者表現(xiàn)為尾巴及四肢癱瘓拖地，后肢雙足跖面向上，抬頭無力。

EAE對照組評分最高，PTX各劑量組評分均較EAE對照組評分下降，差異有顯著性(P < 0.05)，且EAE大鼠腦組織病理學評分隨PTX劑量增加而依次降低，各劑量組間差異有顯著性(P < 0.05)。(見表1)

2.2 腦組織中CD28、CTLA-4含量變化

EAE對照組CD28含量較正常對照組高，CTLA-4含量較正常對照組低，差異有顯著性(P < 0.01)，PTX各劑量組腦組織CD28含量皆較EAE對照組降低，差異有顯著性(P < 0.01)；腦組織CD28含量隨PTX劑量增加而明顯降低，各組間差異有顯著性(P < 0.01)。PTX各劑量組腦組織CTLA-4含量均較EAE對照組升高，差異有顯著性(P < 0.01)；腦組織CTLA-4含量隨PTX劑量增加而明顯增加，PTX大、小劑量組差異有顯著性(P< 0.01)，PTX大與中劑量組、中與小劑量組差異無顯著性(P> 0.05)。(見表2)

Tab.1 The scores of pathological chages in the brain of all the groups

組別Groups腦組織學評分Braintissuescore正常對照組Normalgroup0EAE對照組Modelgroup2.67±0.52PTX小劑量組Smalldosegroup1.61±0.24aPTX中劑量組Middledosegroup1.44±0.22abPTX大劑量組Highdosegroup1.23±0.31abc

注：與EAE對照組相比，aP< 0.05；與PTX小劑量組相比，bP< 0.05；與PTX中劑量組相比，cP< 0.05。

Note.The doses of small,middle,high group were 1 mg/kg,2 mg/kg,4 mg/kg;Compared with model group,aP< 0.05;compared with small dose group,bP< 0.05;compared with middle dose group,cP< 0.05.

Tab.2 The levels of CD28 and CTLA-4 in the brain of all the groups

組別GroupsCD28CTLA-4正常對照組Normalgroup15.3±3.779.7±2.16EAE對照組Modelgroup41.2±4.09a3.6±1.32aPTX小劑量組Smalldosegroup33.9±4.49ab4.3±1.42abPTX中劑量組Middledosegroup26.4±4.14abc5.8±1.81abPTX大劑量組Highdosegroup20.7±4.21abcd6.4±1.68abc

注：與正常對照組相比，aP< 0.01；與EAE對照組相比，b1P< 0.05、b2P< 0.01；與PTX小劑量組相比，cP< 0.01；與PTX中劑量組相比，dP< 0.01。

Note. Compared with normal group,aP< 0.01;compared with model group,b1P< 0.05、b2P< 0.01;compared with small dose group,cP< 0.01;compared with middle dose group,dP< 0.01.

2.3 各實驗組大鼠脾組織上清液BAFF含量測定結(jié)果

與正常對照組相比，EAE對照組及PTX各劑量組脾組織上清液中BAFF含量均增加(P< 0.01)。與EAE對照組比較，PTX各劑量組脾組織上清液中BAFF含量均減少(P< 0.01或P< 0.05)。隨著PTX劑量的增加，BAFF含量依次減少，各組間差異有顯著性(P< 0.01)。(見表3)

Tab.3ThelevelsofBAFFinthesplenictissuefluidofallthegroups

組別GroupsBAFF/pg/mL正常對照組Normalgroup50.2±6.42EAE對照組Modelgroup110.3±10.29aPTX小劑量組Smalldosegroup101.5±6.49ab1PTX中劑量組Middledosegroup87.1±7.88ab2cPTX大劑量組Highdosegroup62.7±6.11ab2cd

注：與正常對照組相比，aP< 0.01；與EAE對照組相比，b1P< 0.05、b2P< 0.01；與PTX小劑量組相比，cP< 0.01；與PTX中劑量組相比，dP< 0.01。

Note.Compared with normal group,aP< 0.01;compared with model group,b1P< 0.05、b2P< 0.01;compared with small dose group,cP< 0.01;compared with middle dose group,dP< 0.01.

3 討論

CD28或CTLA-4/B7協(xié)同刺激分子在EAE中起重要的作用。CD28及CTLA-4(又稱CDl52)均是參與T細胞識別抗原與活化的重要CD分子，CD28與CTLA-4在T細胞上表達的多少與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。研究已證實，給予EAE大鼠CD28抗體治療可以特異性地阻斷Th介導的B細胞分泌免疫球蛋白(Ig)過程[5,6]，特別是EAE大鼠發(fā)病開始時，從而阻斷疾病的進展。CTLA-4可產(chǎn)生負向調(diào)節(jié)信號和抑制細胞周期的進程，涉及的主要機制為抑制TCR和CD28介導IL-2產(chǎn)生[7]，導致免疫反應(yīng)的終止。CTLA-4與CD28具有相反的免疫作用，給予抗CTLA-4抗體可加重EAE大鼠發(fā)病癥狀或?qū)е缕鋸桶l(fā)[8]。CTLA-4還可阻止緩解復發(fā)型的EAE的進程。以上研究均表明CD28或CTLA-4/B7協(xié)同刺激分子在EAE中發(fā)揮重要的作用。

BAFF是1998年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族的新成員，主要由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞合成、中性粒細胞產(chǎn)生。已有研究證實，在有些MS病人T細胞或者單核細胞分泌的BAFF含量增加[8]。對BAFF受體缺乏的大鼠及未缺乏大鼠同時給予抗原建立EAE模型，BAFF受體缺乏的大鼠臨床癥狀提前，且較未缺乏的大鼠臨床癥狀重、神經(jīng)功能障礙評分更高，發(fā)病潛伏期較對照組短，腦脊髓的炎癥范圍更大，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)BAFF含量較對照組增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的炎癥細胞更多，而外周的促炎性細胞因子的數(shù)量增多。在狨猴的EAE模型實驗中，不管是在造模前還是造模后使用抗BAFF的抗體均有助于減少外周血、脾組織淋巴器官中CD20+B細胞數(shù)量、抑制Ig的產(chǎn)生,還能抑制T細胞活化，減少CD4+T細胞數(shù)量。在造模前使用抗BAFF的抗體能顯著降低EAE的發(fā)病率。使用抗BAFF抗體的狨猴癥狀出現(xiàn)時間較未使用抗BAFF抗體的EAE對照組遲，神經(jīng)功能障礙評分、脊髓炎癥浸潤程度及髓鞘脫失程度較對照組低，進展較對照組慢。使用抗BAFF的抗體的狨猴外周血單個核細胞、脾組織及外周淋巴結(jié)IL-17含量較對照組低，而IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6含量減少，TGF-β含量增加，對EAE狨猴繼續(xù)使用抗BAFF的抗體還能使已經(jīng)出現(xiàn)的癥狀具有改善作用[9,10]。

PTX因其良好的抗腫瘤作用廣泛應(yīng)用于臨床，新近的研究表明，PTX除了具有抗腫瘤作用外還具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，新近的研究表明PTX能調(diào)節(jié)腫瘤宿主體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)的數(shù)量，具有免疫調(diào)節(jié)作用。在PTX治療乳腺癌的研究中就發(fā)現(xiàn)，PTX能下調(diào)內(nèi)皮細胞間粘附分子-1的表達，而ICAM-1具有保護血腦屏障受損、減少巨噬細胞進入血腦屏障的作用[11,12]，其還能刺激T淋巴細胞活化的能力、使IL-2、INF-等細胞因子分泌減少，而IL-2、INF-已被證實，是具有加重EAE病情的細胞因子[13]。PTX還可使CD3+T細胞的殺傷活性降低，發(fā)揮其免疫抑制作用。

因此我們認為PTX可能通過誘導淋巴細胞凋亡及抑制淋巴細胞分裂使免疫活性細胞處于高凋亡低增值狀態(tài)，從而抑制機體的免疫功能。以上研究證實，PTX具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,而MS的主要發(fā)病機制就是免疫功能紊亂導致的，PTX通過其免疫調(diào)節(jié)作用可能對治療MS有效。基于以上假設(shè)，并查閱了相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，國外已有研究者將PTX用于EAE大鼠模型，發(fā)現(xiàn)PTX通過其抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能對EAE大鼠發(fā)揮著防治作用，而且PTX還能抑制骨髓未成熟B細胞向外周淋巴器官遷移，減輕MS患者的炎癥反應(yīng)。

本實驗結(jié)果亦證實，PTX對CD28、CTLA-4、BAFF均具有調(diào)節(jié)作用，與EAE對照組比較，PTX各劑量組能降低腦組織內(nèi)CD28、脾組織上清液中BAFF含量，升高腦組織中CTLA-4含量，結(jié)合大鼠腦組織學評分結(jié)果，可推斷PTX可能對EAE具有防治作用。

但本實驗仍具有不足之處，本實驗研究在EAE大鼠疾病高峰期即處死發(fā)病大鼠測定以上細胞因子，故無法動態(tài)觀察CD28、CTLA-4、BAFF等細胞因子的動態(tài)改變；因經(jīng)費原因只測定了CD28、CTLA-4、BAFF含量，未檢測更多免疫細胞及細胞因子含量，未能很好的闡述紫杉醇對EAE大鼠免疫網(wǎng)絡(luò)的影響，且仍有實驗涉及動物數(shù)量較少等局限性存在，仍需后續(xù)的研究完善有關(guān)機制的闡述。

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The effects of paclitaxel on the levels of CD28,CTLA-4 and BAFF in experimental autoimmune encephalomyelitis

ZHANG Shu-jiang,LI Zuo-xiao*

(Department of Neurology,Affiliated Hospital of southwest Medical university,Luzhou 646000,China)

Objective To discuss the effects of Paclitaxel(PTX) on levels of CD28 and CTLA-4,B lymphocyte stimulator(BAFF) in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE).Methods The 50 rats were divided into 5 groups by the random number table, 10 rats in each group,the doses of small group,Middle group, High group were 1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg by intraperitoneal injection for 10 consecutive days, the normal group and model group were injected 0.9% NS 2 mL,Using brain tissue score to estimate the neurological dysfunctions of rats.Using flow cytometry to detect the levels of CD28 and CTLA-4，using enzyme-linked immunosorbent (ELISA) to detect the levels of BAFF.Results The brain tissue score in PTX experimental groups were lower than model group,the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01);The levels of CD28 in PTX groups were lower than EAE group，the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01). The levels of CTLA-4 in PTX groups were higher than EAE group,the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01);the content of BAFF in all PTX groups were lower than EAE control group.Conclusions PTX could decrease the brain tissue score,the mechanism may adjust the express of CD28、CTLA-4 in brain and the expression of BAFF.PTX may have preventive and therapeutic effects on EAE rats.

Paclitaxel;Exexperimental autoimmune encephalomyelitis;CD28;CTLA-4;B lymphocyte stimulator

瀘州市科技創(chuàng)新苗子項目(2016-R-70 20/24)；西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院院級課題。

張淑江(1989-)，女，醫(yī)師，碩士生，研究方向：神經(jīng)免疫。E-mail:939749262@qq.com

李作孝(1964-)，男，主任醫(yī)師，碩士生，研究方向：神經(jīng)免疫。E-mail:lzx3235@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0071-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.016

2016-06-27