C—erbB—2、p—Akt蛋白在乳腺癌中的表達(dá)水平及其在保留NAC的乳腺癌手術(shù)中的臨床意義研究

盛賢能　郭宇　魯楊　王金秋

[摘要] 目的 探討C-erbB-2、p-Akt蛋白在乳腺癌中的表達(dá)水平及其在保留NAC乳腺癌手術(shù)中的臨床意義。 方法 自2010年6月～2011年3月，隨機(jī)選擇86例經(jīng)穿刺病理診斷確診乳腺非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，且符合保留NAC乳腺癌手術(shù)的女性患者為患者組。在我院健康體檢中心隨機(jī)選擇86例健康女性為健康對(duì)照組。對(duì)患者組患者進(jìn)行保留NAC乳腺癌手術(shù)，術(shù)后對(duì)癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行免疫組化染色。檢測(cè)C-erbB-2、p-Akt蛋白在癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平。使用ELISA法對(duì)患者手術(shù)前后及健康對(duì)照組外周血的C-erbB-2、p-Akt表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，記錄各組數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。按照C-erbB-2、p-Akt表達(dá)情況分為雙陽(yáng)性、雙陰性以及單陽(yáng)性。使用Kaplan-Meier法分析患者生存預(yù)后。 結(jié)果 在乳腺癌組織及癌旁正常組織中，C-erbB-2、p-Akt蛋白均有表達(dá)，但在癌組織表達(dá)水平明顯高于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。乳腺癌患者外周血C-erbB-2、p-Akt與健康對(duì)照組相比均明顯升高。Kaplan-Meier法分析患者生存預(yù)后發(fā)現(xiàn)，C-erbB-2、p-Akt均陽(yáng)性表達(dá)者生存率明顯降低，總生存期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 乳腺癌患者外周血C-erbB-2、p-Akt水平明顯高于健康對(duì)照組，C-erbB-2、p-Akt對(duì)患者接受保留NAC乳腺癌術(shù)后生存期有重要的臨床意義。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；C-erbB-2；p-Akt；乳頭乳暈復(fù)合體

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）12-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression level of C-erbB-2 and p-Akt proteins in breast cancer and its clinical significance in breast cancer surgery reserving NAC. Methods From June 2010 to March 2011， 86 patients who were diagnosed with noninvasive ductal carcinoma of the mammary gland by biopsy pathological diagnosis and eligible for breast cancer surgery reserving NAC were randomly selected as the patients group. Another 86 healthy women were selected as the control group， randomly selected from the Physical Examination Center in our hospital. The enrolled patients were given the breast cancer surgery reserving NAC. Immunohistochemical staining was performed on cancer tissues and adjacent normal tissues after the surgery. The expression levels of C-erbB-2 and p-Akt in cancer tissues and adjacent normal tissues were detected， and the expression levels of C-erbB-2 and p-Akt in the peripheral blood before and after the surgery and in the healthy control group were detected by ELISA. The data of each group were recorded and analyzed statistically. According to the expression of C-erbB-2 and p-Akt， the expression was divided into double positive， double negative and single positive. Kaplan-Meier method was used to analyze the prognosis of patients. Results C-erbB-2 and p-Akt proteins were expressed in breast cancer tissues and adjacent normal tissues， but the expression levels in cancer tissues were significantly higher than those in normal tissues. The difference was statistically significant（P<0.05）. The levels of C-erbB-2 and p-Akt in the peripheral blood of patients with breast cancer were significantly higher than those in the healthy control group. Kaplan-Meier method was used to analyze the survival prognosis， indicating that the survival rate of the patients with positive C-erbB-2 and p-Akt was significantly decreased， the overall survival time was significantly shorter， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The levels of C-erbB-2 and p-Akt in peripheral blood of the patients with breast cancer are significantly higher than those in healthy control group， and C-erbB-2 and p-Akt have important clinical significance in the postoperative survival period of the patients receiving breast cancer reserving NAC.

[Key words] Breast cancer； C-erbB-2； p-Akt； Nipple-areola complex （NAC）

乳腺癌是指乳腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，占女性所有惡性腫瘤的20%以上，成為威脅女性身體健康的重要?dú)⑹諿1]。隨著乳腺癌患者對(duì)生活質(zhì)量的要求越來越高，患者對(duì)術(shù)后美觀程度的要求也越來越高，保留乳頭乳暈復(fù)合體的乳腺癌根治術(shù)也得到了廣泛的應(yīng)用[2]。保留乳頭乳暈復(fù)合體（nipple-areolar complex， NAC）對(duì)乳腺癌患者乳房重建的美容效果和術(shù)后生活質(zhì)量有重要意義。但是保留NAC的乳腺癌術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)即復(fù)發(fā)研究尚不明確[3]。因此，探討保留NAC的乳腺癌術(shù)后標(biāo)志物對(duì)于研究其發(fā)病機(jī)制以及疾病預(yù)后具有重要的臨床意義[4]。本研究主要使用C-erbB-2、p-Akt蛋白聯(lián)合評(píng)價(jià)保留NAC手術(shù)后患者的生存預(yù)后，并進(jìn)一步探討C-erbB-2、p-Akt蛋白的臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料

自2010年6月～2011年3月，隨機(jī)選擇86例經(jīng)穿刺病理診斷確診乳腺非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，且符合保留NAC乳腺癌手術(shù)的女性患者為患者組。在我院健康體檢中心隨機(jī)選擇86例健康女性為健康對(duì)照組。兩組年齡、BMI等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

1.2乳腺癌患者入組標(biāo)準(zhǔn)[5]

（1）自2010年6月～2011年3月，在我院通過病理學(xué)診斷確診乳腺癌的患者。（2）入組患者均為女性，年齡42～67歲，臨床資料及病理資料均完整；（3）入組患者均需要符合保留乳頭乳暈復(fù)合體乳腺癌手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，即：①適用于Ⅰ、Ⅱa期乳腺癌患者；②非中央?yún)^(qū)乳腺癌，腫瘤邊緣距乳暈邊緣直線距離≥3 cm；③腫瘤最大徑≤3 cm；④乳頭無溢液、無濕疹樣改變、無內(nèi)陷及歪斜等異常表現(xiàn)；⑤乳暈及邊緣皮膚無桔皮樣改變；⑥保留的乳頭乳暈區(qū)皮下組織取樣冰凍病理報(bào)告無癌細(xì)胞浸潤(rùn)。（4）患者術(shù)前未接受放療或化療等治療。

1.3 乳腺癌患者排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）合并其他系統(tǒng)的惡性腫瘤，不包括乳腺癌轉(zhuǎn)移到其他病灶者；（2）不能明確診斷者；（3）認(rèn)知障礙或患精神疾病者；（4）某些原因?qū)е挛茨苋〉貌±順颖菊撸唬?）患者或家屬不配合；（6）某些原因?qū)е轮型就顺霰狙芯空撸唬?）患者一般情況較差，不適合進(jìn)行檢查及治療者。（8）患者術(shù)前接受過放療或化療等治療。

1.4免疫組化方法

乳腺癌組織石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2，20℃孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min重復(fù)兩次；使用5%PBS稀釋的山羊血清（Life Technologies，美國(guó)）封閉，20℃孵育10 min，倒去山羊血清，滴加一抗（anti-C-erb-2，anti-p-Akt，ab60709，Abcam，美國(guó)），在37℃下孵育1～2 h或在4℃冰箱中過夜保存；將“生物素標(biāo)記二抗”（Perkin-Elmer）工作液滴加適量到樣品上，37℃孵育10 min；滴加辣根過氧化物酶（Sigma，S7571，美國(guó)），37℃孵育10 min；向1 mL DAB Plus Substrate（TA-125-HDX，Thermo Scientific，美國(guó)）中滴加1～2滴DAB Plus Chromogen（TL-125-HD，Thermo Scientific，美國(guó)），混勻后滴加到切片上，37℃孵育10 min后，沖洗封片。

1.5 ELISA檢測(cè)方法

采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者血清C-erbB-2、p-Akt蛋白的表達(dá)水平，本研究所有試劑均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，操作完全按照說明書進(jìn)行。

1.6 手術(shù)方法

局麻下小切口（4～5 cm）切除腫瘤，病理結(jié)果報(bào)告為癌后，在全麻下行保留NAC的乳腺癌改良根治術(shù)。以活檢切口為軸，在距切口皮膚3～5 cm左右作一梭形切口，切除乳腺腫瘤表面的部分皮膚，向四周游離皮瓣，皮瓣下留有薄層脂肪，保留乳頭乳暈，其基底部留有薄層腺體組織，術(shù)中取樣冰凍切片。由內(nèi)下沿胸大肌表面向上外連同胸肌筋膜一并切除至胸大肌外側(cè)緣， 根據(jù)清除腋淋巴結(jié)的需要而延長(zhǎng)切口或另行選擇切口，拉起胸大肌外側(cè)緣，清除腋窩淋巴結(jié)，整塊切除手術(shù)標(biāo)本。如診斷為浸潤(rùn)性癌者，術(shù)后需要接受化療。

1.7 觀察指標(biāo)

觀察患者手術(shù)前后ELISA檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)結(jié)果及術(shù)后5年生存率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)所收集資料采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用例數(shù)或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Log Rank時(shí)序檢驗(yàn)以及COX多因素分析對(duì)患者臨床預(yù)后進(jìn)行分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者組及健康對(duì)照組一般臨床資料比較

患者組及健康對(duì)照組一般臨床資料比較，兩組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表1。乳腺癌患者病理類型均為導(dǎo)管癌。

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

手術(shù)前后使用ELISA法檢測(cè)患者外周血C-erbB-2、p-Akt蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，術(shù)前患者組外周血C-erbB-2、p-Akt蛋白水平均明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后患者組外周血C-erbB-2蛋白水平明顯減低至（1.805±0.001）ng/mL，低于術(shù)前（2.814±0.825）ng/mL（P<0.05），但與健康對(duì)照組相比，水平明顯較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。p-Akt結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患者組血清p-Akt水平明顯減低，但與健康對(duì)照組相比則明顯較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 免疫組化結(jié)果

術(shù)中留取患者乳腺癌組織以及癌旁正常組織進(jìn)行免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)，C-erbB-2、p-Akt蛋白在患者乳腺癌組織以及癌旁正常組織中均有表達(dá)，但乳腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖1 A～E。

2.4 生存預(yù)后分析

使用Kaplan-Meier法對(duì)術(shù)后隨訪患者的5年生存率進(jìn)行分析并最終發(fā)現(xiàn)，癌組織C-erbB-2、p-Akt雙陽(yáng)性患者中位生存期和5年總生存率明顯低于單陽(yáng)性者和雙陰性者，見封三圖2。

3 討論

隨著女性乳腺癌患者對(duì)生活質(zhì)量和形體美的要求越來越高，保留乳頭乳暈的乳腺癌根治術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛[6]。目前臨床上通常使用保乳手術(shù)聯(lián)合Ⅰ期或Ⅱ期乳房再造手術(shù)進(jìn)行治療[7]。但是，大部分東方女性乳房體積較小，如限制切除范圍則影響手術(shù)治療效果，這也是目前保乳手術(shù)治療的主要障礙[8]。探索特異性的腫瘤標(biāo)志物可能對(duì)預(yù)測(cè)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)以及預(yù)后提示具有重要意義[9]。

C-erbB-2基因又稱為neu或HER-2基因，是一種細(xì)胞原癌基因，在多種腫瘤中其癌基因及其蛋白產(chǎn)物（P185）均有過度表達(dá)和擴(kuò)增[10-11]。對(duì)C-erbB-2癌基因蛋白產(chǎn)物P185的病理研究首先多見于乳腺癌，其作用也較為明確[12]。目前普遍認(rèn)為，C-erbB-2蛋白產(chǎn)物的陽(yáng)性表達(dá)可作為判斷乳腺癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者中，癌旁正常組織及乳腺癌組織中均可見C-erbB-2蛋白表達(dá)，但癌組織中表達(dá)水平明顯增高，這一結(jié)果與既往研究較為相似，在多種女性有關(guān)的腫瘤中，均可見C-erbB-2表達(dá)異常，包括子宮內(nèi)膜癌[14]、卵巢癌[10]以及乳腺癌[15]等。此外，C-erbB-2也可以通過與胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）聯(lián)合作用共同調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[10]。有研究結(jié)果提示，乳腺癌的發(fā)生可能與C-erbB-2基因異常表達(dá)有關(guān)[16]。

p-Akt是磷酸化的Akt，既往報(bào)道Akt信號(hào)通路在多種癌癥疾病中均有表達(dá)，如肺癌[17]、胃癌[18]等常見腫瘤。目前，Akt及其信號(hào)通路是基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域中最熱門的激酶和激酶通路之一[19]。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)是必要的，其活化與腫瘤發(fā)生及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。在Hela細(xì)胞中，有研究發(fā)現(xiàn)，干擾素β可以通過NF-κB/p-Akt的信號(hào)通路有效促進(jìn)低劑量順鉑的治療作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺導(dǎo)管癌患者中，p-Akt蛋白在健康乳腺組織、癌組織和癌旁正常組織中均有表達(dá)，但在癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果表明，Akt信號(hào)通路在乳腺組織癌變的過程中也發(fā)揮了重要的作用。

此外，運(yùn)用Kaplan-Meier分析本組乳腺癌患者生存情況后發(fā)現(xiàn)，C-erbB-2和p-Akt雙陽(yáng)性的乳腺癌患者5年生存率明顯低于單陽(yáng)性者與雙陰性的乳腺癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。我們分析，C-erbB-2和p-Akt高表達(dá)可能提示乳腺癌患者體內(nèi)的癌組織處于旺盛的增殖狀態(tài)。此外，由于保留NAC乳腺癌手術(shù)的切除范圍較為有限[23]，在這部分患者中可能存在潛在的乳腺癌轉(zhuǎn)移灶，影響了患者的臨床預(yù)后。因此，我們認(rèn)為，對(duì)于外周血檢測(cè)C-erbB-2和p-Akt表達(dá)水平增高的非浸潤(rùn)性乳腺癌患者而言，并不適合進(jìn)行保留乳頭乳暈復(fù)合體的治療方法。

綜上所述，乳腺癌患者外周血C-erbB-2、p-Akt水平明顯高于健康對(duì)照組，檢測(cè)C-erbB-2、p-Akt的表達(dá)水平對(duì)患者接受保留NAC乳腺癌術(shù)后的總生存期有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2017-02-24）