大動脈粥樣硬化型腦梗死患者TLR4基因多態性觀察

鐘曉，王嶺，徐翔，楊陳麗，孫麗

(青島大學醫學院第二附屬醫院，山東青島266011)

大動脈粥樣硬化型腦梗死患者TLR4基因多態性觀察

鐘曉，王嶺，徐翔，楊陳麗，孫麗

(青島大學醫學院第二附屬醫院，山東青島266011)

目的 觀察中國膠東半島地區大動脈粥樣硬化(LAA)型腦梗死漢族患者TLR4基因的rs1927911、rs1927914、rs2149356位點單核苷酸多態性情況。方法 將LAA型腦梗死患者105例納入病例組，選擇同期健康體檢者125例納入對照組。采用PCR-RFLP法或直接測序法觀察兩組白細胞TLR4基因rs1927911、rs1927914、rs2149356位點的單核苷酸多態性情況。結果 兩組各多態性位點的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。病例組TLR4基因rs1927911位點CC、TT基因型頻率低于對照組，CT基因型頻率高于對照組(P均<0.05)。病例組rs2149356位點CC、AC基因型頻率低于對照組，AA基因型頻率高于對照組，A等位基因頻率高于對照組(P均<0.05)。結論 中國膠東半島地區LAA型腦梗死漢族患者白細胞TLR4基因rs1927911、rs2149356位點多態性可能與LAA型腦梗死的發病有關。

Toll樣受體4基因；腦梗死；動脈粥樣硬化；大動脈粥樣硬化型腦梗死；基因多態性

高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒等是缺血性腦梗死主要的危險因素，然而有不少腦梗死患者并不存在上述常見危險因素。研究發現具有不同病因的缺血性腦梗死的遺傳學背景不同[1～3]，認為缺血性腦梗死是由多因素共同作用的多基因遺傳病[4]。其中，大動脈粥樣硬化(LAA)型腦梗死受遺傳因素影響可能更明顯。研究[5]證實，炎癥引起的免疫反應貫穿于動脈粥樣硬化(AS)的始終。Toll樣受體(TLRs)是一種模式識別受體，其中TLR4在AS的多個病理階段都發揮重要作用。有學者[6]研究證實，TLR4在正常血管內皮細胞中表達甚少，而在AS患者的內皮細胞中表達顯著增高。研究[7，8]發現TLR4基因中的3個位點(rs1927911、rs1927914、rs2149356)單核苷酸多態性與心血管疾病、血脂水平、AS等有關。但在漢族人群中，有關缺血性腦梗死受遺傳因素影響的報道較少。因此，我們觀察了中國膠東半島地區LAA型腦梗死漢族患者TLR4基因的rs1927911、rs1927914、rs2149356位點單核苷酸多態性情況，探討TLR基因多態性與LAA型腦梗死的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年6月～2016年6月在青島大學第二附屬醫院神經內科就診的LAA型腦梗死患者(病例組)和同期健康體檢者(對照組)。所有研究對象均為長期生活在中國膠東半島地區的漢族人，且年齡、性別相匹配，具有可比性。病例組105例均符合第四屆全國腦血管病學術會議制定的LAA型腦梗死診斷標準；排除外傷、動脈炎、心源性栓塞、藥物、血液病、動脈瘤、腦血管畸形或腫瘤等其他原因所引起的腦梗死者，伴有嚴重心臟疾病及近期發生急性心肌梗死、心絞痛者，近期服用抗血小板和抗凝藥物者，嚴重肝腎疾病、自身免疫性疾病、心功能衰竭、慢性肺部疾病、嚴重感染性疾病、腫瘤、梗死后出血患者，近期手術患者，合并妊娠者。對照組128例均經腦血管檢查證實無血管狹窄及AS，且經MRA、CTA、DSA等檢查證實無中、重度顱內外大動脈狹窄表現。所有受試者在禁食12 h后，于入院的第2天清晨抽取前臂靜脈血，用于生化指標的檢測及白細胞DNA的提取。兩組年齡、性別、吸煙、飲酒、冠心病發生情況、TG、TC差異無統計學意義；病例組合并高血壓比例、合并糖尿病比例、LDL水平高于對照組，HDL水平低于對照組(P均<0.05)。見表1、2。

表1 兩組性別、飲酒、吸煙情況及合并疾病情況比較(例)

表2 兩組年齡及血脂指標比較

1.2 白細胞TLR4基因rs1927911、rs1927914、rs2149356多態性觀察

1.2.1 白細胞DNA提取 抽取前臂靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中，固定2 h，常溫下3 000 r/min離心10 min，收集白細胞層置于eppendof管中，放在-80 ℃冰箱中備用。將白細胞標本從冰箱取出后完全熔化，提取白細胞DNA。

1.2.2 rs1927911、rs1927914、rs2149356位點基因序列擴增 用梯度PCR儀分別擴增TLR4基因的rs1927911、rs1927914、rs2149356位點的目的基因片段。引物經Premier軟件設計，由上海生物工程有限公司合成。rs1927911位點上游引物序列為5′-AACCTGCATGCTCTGCACATG-3′，下游引物序列為5′-ACCATGGGAATCCATGCAC-3′，產物長度247 bp，限制性內切酶為StyI；rs1927914位點上游引物序列為5′-CGCATGTGTTTTGAATTACTGAATT-3′，下游引物序列為5′-AATAATCTCAATACTCAGAGCAAAGCTTT-3′，產物長度454 bp，限制性內切酶為SphI；rs2149356位點上游引物序列為5′-CAGATGTGATGGGTCATATGATTGT-3′，下游引物序列為5′-CAAAACTCGCTCCTATCACCTGTT-3′，產物長度500 bp，直接測序。rs1927911、rs1927914、rs2149356位點的PCR反應體系和反應條件均相同。總反應體系20 μL，包括雙蒸水8 μL，2×Taq PCR Master Mix(不含染料)10 μL，模板DNA 1 μL，上游、下游引物各0.5 μL。PCR反應條件為預變性94 ℃ 30 s，變性94 ℃ 15 s，退火58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增結束后，用瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。擴增產物放在4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 rs1927911、rs1927914、rs2149356位點基因型鑒定 rs1927911位點的PCR擴增產物經StyI酶在37 ℃下酶切約60 min，rs1927914位點的PCR擴增產物經SphI酶在37 ℃下酶切約90 min；rs1927911、rs1927914位點的PCR產物酶切反應體系相同，總體積10 μL(雙蒸水3.6 μL，PCR擴增產物5 μL，10×buffer 1 μL，限制性內切酶0.4 μL)，酶切反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像系統觀察電泳結果，見圖1、2。rs2149356沒有天然內切酶，因此采用直接測序法鑒定基因型，見圖3。

注：a、b、c代表基因型分別為CT、TT、CC。

注：a、b、c代表基因型分別為CT、CC、TT。

注：a、b、c代表基因型分別為CC、AC、AA。

2 結果

兩組各核苷酸多態性位點的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，本研究選擇的樣本具有群體代表性。病例組TLR4基因rs1927911位點CC、TT基因型頻率低于對照組，CT基因型頻率高于對照組(P均<0.05)。病例組rs2149356位點CC、AC基因型頻率低于對照組，AA基因型頻率高于對照組，A等位基因頻率高于對照組(P均<0.05)。兩組rs1927914位點基因型頻率及等位基因頻率差異無統計學意義(P均>0.05)。詳見表3～5。

表3 兩組rs1927911位點基因型與等位基因頻率比較(%)

表4 兩組rs1927914位點基因型與等位基因頻率比較(%)

表5 兩組rs2149356位點基因型與等位基因頻率比較(%)

3 討論

炎癥在AS的發生和發展中都起到重要作用。TLR4主要表達于巨噬細胞和血管內皮細胞，尤其在脂質豐富的血管內皮細胞和巨噬細胞中表達水平顯著提高。血管壁中巨噬細胞分化為泡沫細胞是AS形成的早期標志，TLR4在泡沫細胞的形成中發揮重要作用。巨噬細胞中激活的TLR4能引起一系列信號級聯反應，誘導炎癥因子、蛋白酶表達，進一步促進AS形成。有學者[9～11]發現，MyD88/ApoE都被敲除的小鼠相比只有ApoE被敲除的小鼠發生AS的概率小，病變處的脂質和巨噬細胞明顯減少，內膜損傷程度也較輕。髓樣分化因子88是TLR4細胞內部分的信號轉導通路中關鍵的銜接蛋白，能夠啟動下游炎癥因子轉導[12，13]。研究[14]發現，在細菌多糖刺激套囊誘導新內膜形成和結扎頸內動脈血流中斷的小鼠模型中，TLR4缺陷小鼠均無新內膜形成和向外的血管重塑，而野生型小鼠出現新內膜形成和血管向外重塑，且其程度與TLR4基因表達水平相關，這表明TLR4參與血管重塑并引起血管腔進一步狹窄[15]。Castrillo等[16]進一步證實TLR4可抑制巨噬細胞中膽固醇外流，促進斑塊的發生。因此，TLR4基因高表達可影響AS的形成、血管重塑及斑塊的穩定性等，從而促進動脈血管狹窄、閉塞，是LAA型腦梗死發生的重要原因。

本研究觀察了長期生活在中國膠東半島地區漢族LAA型腦梗死患者白細胞TLR4基因rs1927911、rs1927914及rs2149356位點的多態性，結果顯示，病例組TLR4基因rs1927911位點CC、TT基因型頻率低于對照組，CT基因型頻率高于對照組。病例組rs2149356位點CC、AC基因型頻率低于對照組，AA基因型頻率高于對照組，A等位基因頻率高于對照組。Enquobahrie等[17]對華盛頓人群進行病例對照研究未曾發現TLR4基因中rs1927911位點多態性與缺血性腦梗死有關，但發現rs1927911位點多態性可降低心肌梗死的危險性。眾所周知，TC/HDL比值水平可影響動脈粥樣硬化的發生和發展，進而增加LAA型腦梗死的患病風險。有學者[8]在研究TLR4基因多態性與2型糖尿病患者TC/HDL-C比值的關系時發現，rs2149356位點雜合子較純合子可能更易于提高TC/HDL-C的比值，這與我們的研究結果基本相一致，因此我們認為rs2149356位點多態性可能影響AS的發生和發展。

另外，本研究未發現rs1927914位點多態性與LAA型腦梗死有相關性。研究[17]發現rs1927914位點多態性可降低心肌梗死的危險性，未發現rs1927914位點多態性與缺血性腦梗死有關。這與我們的研究結果基本基本一致，具體有待于進一步研究探索。

綜上所述，中國膠東半島地區LAA型腦梗死漢族患者白細胞TLR4基因rs1927911、rs2149356位點多態性可能與LAA型腦梗死的發病有關。

[1] Dichgans M, Markus HS. Genetic association studies in stroke: methodological issues and proposed standard criteria[J]. Stroke, 2005,36(9):2027-2031.

[2] Kim Y, Lee C. The gene encoding transforming growth factor beta 1 confers risk of ischemic stroke and vascular dementia[J]. Stroke, 2006,37(11):2843-2845.

[3] Jerrard-Dunne P, Sitzer M, Risley P, et al. Inflammatory gene load is associated with enhanced inflammation and early carotid atherosclerosis in smokers[J].Stroke, 2004,35(11):2438-2443.

[4] Holliday EG, Maguire JM, Evans TJ, et al.Common variants at 6p21.1 are associated with large artery atherosclerotic stroke. Common variants at 6p21.1 are associated with large artery atherosclerotic stroke[J]. Nat Genet, 2012,44(10):1147-1151.

[5] 耿小勇,陳一文,秦明照.Toll樣受體4在動脈粥樣硬化中的作用研究進展[J].中國動脈硬化雜志,2008,16(1):78-80.

[6] Edfeldt K, Swedenborg J, Hansson GK, et al. Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions: a possible pathway for plaque activation[J]. Circulation, 2002,105(10):1158-1161.

[7] Enquobahrie DA, Smith NL, Bis JC, et al. Cholesterol ester transfer protein, interleukin-8, peroxisome proliferator activator receptor alpha, and Toll-like receptor 4 genetic variations and risk of incident nonfatal myocardial infarction and ischemic stroke[J]. Am J Cardiol, 2008,101(12):1683-1688.

[8] Kolz M, Baumert J, Muller M, et al. Association between variations in the TLR4 gene and incident type 2 diabetes is modified by the ratio of total cholesterol to HDL-cholesterol[J]. BMC Medical Genetics, 2008,9(1):9.

[9] Punturieri A,Alviani RS,Polak T,et al. Specific engagement of TLR4 or TLR3 does not lead to IFN-beta-mediated innate signal amplification and STAT1 phosphorylation in resident murine alveolar macrophages[J]. J Immunol, 2004,173(2):1033-1042.

[10] Bjorkbacka H, Kunjathoor VV, Moore KJ, et al. Reduced atherosclerosis in MyD88-null mice links elevated serum cholesterol levels to activation of innate immunity signaling pathways[J]. Nat Med, 2004,10(4):416-421.

[11] Michelsen KS, Wong MH, Shah PK, et al. Lack of Toll-like receptor 4 or myeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein E[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(29):10679-10684.

[12] Byrd-Leifer CA, Block EF, Takeda K, et al. The role of MyD88 and TLR4 in the LPS-mimetic activity of Taxol[J]. Euro J Immun, 2001,31(8):2448-2457.

[13] McGettrick AF, O′Neill LA. The expanding family of MyD88-like adaptors in Toll-like receptor signal transduction[J]. Mol Immunol, 2004,41(6-7):577-582.

[14] Hollestelle SC, De Vries MR, Van Keulen JK, et al. Toll-like receptor 4 is involved in outward arterial remodeling[J]. Circulation (Baltimore), 2003,109(3):393-398.

[15] Palsson-McDermott EM, O′Neill LA. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4[J]. Immunology, 2004,113(2):153-162.

[16] Castrillo A, Joseph SB, Vaidya SA, et al. Crosstalk between LXR and toll-like receptor signaling mediates bacterial and viral antagonism of cholesterol metabolism[J]. Mol Cell, 2003,12(4):805-816.

[17] Enquobahrie DA, Smith NL, Bis JC, et al. Cholesterol ester transfer protein, interleukin-8, peroxisome proliferator activator receptor alpha, and Toll-like receptor 4 genetic variations and risk of incident nonfatal myocardial infarction and ischemic stroke[J]. Am J Cardiol, 2008,101(12):1683-1688.

孫麗(E-mail: 875826289@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.022

R743.3

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1002-266X(2017)15-0074-04

2016-12-26)