食管鱗癌組織中自噬相關基因9B mRNA及蛋白的表達變化

王玲玲，李蒙妍，賈永旭，常志偉，秦艷茹

(鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450000)

食管鱗癌組織中自噬相關基因9B mRNA及蛋白的表達變化

王玲玲，李蒙妍，賈永旭，常志偉，秦艷茹

(鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450000)

目的 觀察食管鱗癌(ESCC)組織中自噬相關基因(ATG9B)9B mRNA及蛋白的表達變化，并探討其意義。方法 食管癌切除術中切取的新鮮ESCC組織及癌旁正常黏膜組織各70例份，采用qRT-PCR法檢測ATG9B mRNA。收集198例份食管癌根治切除術留取的ESCC組織及癌旁正常黏膜組織標本構建組織芯片，采用免疫組化法檢測ATG9B蛋白，分析ATG9B蛋白表達與ESCC臨床病理參數的關系。結果 ESCC組織、正常食管黏膜組織中ATG9B mRNA相對表達量分別為0.303±0.197、1.186±0.642，ESCC組織中ATG9B mRNA相對表達量低于正常食管黏膜組織(P<0.05)。ESCC組織中ATG9B蛋白陽性表達率低于正常食管黏膜組織(分別為32.6%、60.5%,P<0.05)。ATG9B蛋白在高、中、低分化ESCC組織中陽性表達率依次降低，在Ⅰ～Ⅱ期腫瘤組織中的陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期組織(P均<0.05)。結論 ESCC組織中ATG9B mRNA及蛋白表達均低于正常食管黏膜組織；ATG9B表達下調可能與ESCC的發生發展有關。

食管腫瘤；食管癌；食管鱗癌；自噬相關基因9B；自噬

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，食管鱗癌(ESCC)是其最常見的病理類型。盡管食管癌的早期診斷和治療都有了巨大進步，但患者預后仍然很差，5年生存率不足16%。近年來，許多研究表明自噬與人類疾病密切相關。目前腫瘤治療以誘導細胞凋亡為主，自噬被稱為是Ⅱ型程序性細胞死亡，它與凋亡復雜的關系為腫瘤治療研究提供了新方向。本課題組前期研究發現ESCC癌旁正常組織中自噬相關基因9B(ATG9B)表達高于ESCC組織幾十倍。研究[1]表明ATG9B在乳腺癌組織中低表達，認為ATG9B作為抑癌基因在乳腺癌的發生發展過程中發揮了重要作用。本研究觀察了ESCC組織中ATG9B mRNA及蛋白的表達變化，并探討其與食管鱗癌臨床病理參數的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本 食管癌切除術中切取的新鮮ESCC組織及癌旁正常黏膜組織各70例份，獲取組織后迅速置于凍存管并儲存于液氮中，用于RNA提取。收集198例份食管癌根治切除術留取的ESCC組織及癌旁正常黏膜組織標本用于構建組織芯片。198例份標本來源患者中，男110例、女88例，年齡40～80歲，WHO分級Ⅰ級39例、Ⅱ級97例、Ⅲ級62例，TNM分期Ⅰ期23例、Ⅱ期87例、Ⅲ期76例、Ⅳ期12例，有淋巴結轉移者75例，所有患者術前都未接受化療或放療。

1.2 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ATG9B mRNA檢測 采用TRIzol法提取ESCC組織及癌旁正常組織總RNA，檢驗RNA完整性后，各取2 000 ng總RNA按FastQuant RT Kit說明書進行逆轉錄，得到的cDNA用雙蒸水稀釋備用。ATG9B上游引物序列為5′-CCCCTCATACAAGAAGCTCCC-3′，下游引物序列為5′-TGCAGGTTGAGCCTGTGTTG-3′，擴增產物長度150 bp；內參β-actin上游引物序列為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物序列為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，擴增產物長度250 bp。用cDNA進行qRT-PCR反應，反應條件：50 ℃反應2 min，95 ℃反應10 min，95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min，95 ℃反應15 s，60 ℃反應15 s，共45個循環。用PCR儀的序列檢測系統對反應產物進行定量檢測，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.3 ESCC組織及正常食管黏膜組織中ATG9B蛋白檢測 光鏡下對組織切片進行形態學觀察，選擇ESCC組織及癌旁正常組織標本中有代表性的2個區域并標記；制作空白蠟塊即受體蠟塊，并用組織芯片制作儀在受體蠟塊上打洞(間距0.9 mm、直徑1.0 mm、深度3～4 mm)，將所需ESCC組織及癌旁組織在標本中穿刺取出并植入受體蠟塊中，組織芯片蠟塊制作完成后做4 μm厚連續切片，裱于預先硅化好的玻片上備用。采用免疫組化法檢測ATG9B蛋白。組織芯片在二甲苯及梯度乙醇中常規脫蠟、水化，置于微波加熱至沸騰的EDTA緩沖液中20 min，自然冷卻至室溫進行熱抗原修復，PBS洗滌5 min×3次；滴加3% H2O2，平放于濕盒中，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次；非免疫山羊血清封閉，滴加特異性一抗工作液(5% BSA溶于PBS中)，置于濕盒中，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌5 min×3次；甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中，滴加特異性二抗工作液于組織上，置于濕盒中，室溫孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次；滴加顯色劑DAB工作液，顯色完全后用蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復染30 s，蒸餾水沖洗終止顯色；梯度乙醇脫水，置二甲苯中透明5 min，封片。以抗體稀釋液代替一抗為陰性對照，以已知陽性表達的組織切片為陽性對照。光鏡下觀察組織切片，ATG9B主要在細胞質中表達，根據染色強度和陽性細胞百分比判定結果：染色強度為不顯色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分，陽性細胞百分比<25%計1分、25%～<50%計2分、50%～<75%計3分、≥75%計4分；兩項得分相乘，<3判定為ATG9B蛋白表達陰性，≥3判定為ATG9B蛋白表達陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件。計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

ESCC組織、正常食管黏膜組織中ATG9B mRNA相對表達量分別為0.303±0.197、1.186±0.642，ESCC組織中ATG9B mRNA相對表達量低于正常食管黏膜組織(P<0.05)。ESCC組織中ATG9B蛋白陽性表達率為32.6%(62/190)，正常食管黏膜組織中ATG9B蛋白表達陽性率為60.5%(115/190)，ESCC組織中ATG9B蛋白陽性表達率低于正常食管黏膜組織(P<0.05)。ATG9B蛋白在高、中、低分化ESCC組織中陽性表達率依次降低，在Ⅰ～Ⅱ期腫瘤組織中的陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期組織(P均<0.05)。ATG9B蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤浸潤及淋巴結轉移情況無關(P均>0.05)。見表1。

3 討論

細胞在饑餓、缺氧、能量缺乏等情況下可通過自噬降解受損的細胞器及蛋白質等大分子物質，借以維持物質能量平衡及內環境穩定[2,3]。自噬的過程可以概括5個步驟：①雙層膜結構自噬泡形成的起始；②自噬泡的延伸；③自噬泡的成熟并轉化為自噬小體；④自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體；⑤生物材料在自噬溶酶體內的降解[4]。大量研究[5～7]發現，自噬通過多種途徑抑制腫瘤的發生，如清除受損細胞器、減少活性氧導致的DNA損傷、維持基因組完整性、抑制細胞過度增殖、抑制炎癥、誘發程序性細胞死亡等。目前已知的ATG有30多個，其在進化中高度保守，參與機體多種生理病理過程[8,9]。ATG的改變在腫瘤發生發展中發揮一定的作用，其在腫瘤早期診斷及治療評估中的價值也成為研究的熱點。現已證實與酵母自噬相關基因ATG6同源的人類beclin1基因所編碼蛋白質參與自噬體形成、腫瘤的發生發展和神經變性等過程[10]。食管腺癌、肝癌、膽管癌和胰腺癌中，beclin1的表達水平和細胞自噬活動被明顯抑制[11～13]。

表1 ATG9B蛋白表達與ESCC臨床病理參數的關系(例)

注：與低分化者相比，*P<0.05；與中分化者相比，#P<0.05；與Ⅲ～Ⅳ期者相比，△P<0.05。

ATG9B基因定位于染色體7q36，是ATG家族的一員，與ATG9同源，編碼的自噬相關蛋白由924個氨基酸組成，是一種多次跨膜蛋白，高表達于胎盤滋養層細胞和腦垂體，在細胞分化、增殖和組織器官的發育過程中起重要作用[14]。在酵母菌中，ATG9B參與自噬泡形成，在自噬早期起作用。Yamamoto等[15]發現大多數的ATG9B存在于胞質中流動的小囊泡中，這種囊泡被特指為ATG9B囊泡，在饑餓狀態下，多個ATG9B囊泡單獨組合到前自噬體結構中，然后被并入自噬體膜中，這一發現證實了ATG9B囊泡和自噬體膜之間的關系。有研究[16]表明，ATG9B可能直接或間接參與自噬囊泡膜的融合及彎曲變形，也可能作為載脂蛋白而發揮作用。自噬過程受到多種信號分子的調控，如mTOR、becclin 1、MAPK、p53等，其中備受關注的是經典PI3K/Akt/mTOR信號通路[17,18]。自噬泡的形成需要ATG1激酶與ATG13、ATG17結合[19,20]。正常狀態下，mTOR可磷酸化ATG13并使之與ATG1解離，抑制自噬流的傳導；在饑餓狀態或雷帕霉素抑制mTOR活性時，ATG13去磷酸化后與ATG1結合，促進自噬體膜結構出現[21]。我們推測ATG9B表達下調，使ATG9B囊泡形成減少，抑制自噬泡形成，阻止自噬的啟動，導致惡性腫瘤的發生。然而目前ATG9B下調的機制尚不明確，需要進一步探究。

本研究觀察了ATG9B在ESCC組織中的表達變化，結果顯示，ESCC組織中ATG9B mRNA相對表達量低于正常食管黏膜組織，ESCC組織中ATG9B蛋白陽性表達率低于正常食管黏膜組織，提示ESCC組織中ATG9B mRNA及蛋白表達下調，ATG9B表達異常可能與ESCC的發病有關。我們還發現，ATG9B蛋白在高、中、低分化ESCC組織中陽性表達率依次降低，在Ⅰ～Ⅱ期腫瘤組織中的陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期組織，提示在ESCC發病過程中，ATG9B活性下降或功能缺失抑制了自噬啟動，進而促進了ESCC的發生發展。推測其可能機制:細胞自噬減少或自噬缺失的細胞不能及時清除受損線粒體及過氧化物酶體，這些受損細胞器是活性氧的潛在來源，而活性氧易導致DNA損傷和染色體不穩定，最終誘發或促進腫瘤的發生。本研究結果為進一步探索食管癌發病機制、尋找食管癌早期診斷標志物、開辟新的治療途徑、改善患者預后有著重要意義。

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國家自然科學基金資助項目(81472605)。

秦艷茹(E-mail: yanruqin@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.014

R735.1

B

1002-266X(2017)15-0051-03

2016-12-19)