子宮肌瘤細胞中孕激素受體M、A/B及porin蛋白表達觀察

封全靈，王智霆，劉慧云

(鄭州大學第三附屬醫院，鄭州450052)

子宮肌瘤細胞中孕激素受體M、A/B及porin蛋白表達觀察

封全靈，王智霆，劉慧云

(鄭州大學第三附屬醫院，鄭州450052)

目的 觀察子宮肌瘤細胞中孕激素受體M(PR-M)、孕激素受體A/B(PR-A/B)及porin蛋白的表達變化，并探討其意義。方法 子宮肌瘤切除術中切取子宮肌瘤組織及瘤旁正常子宮平滑肌組織后冰上盡快送實驗室，原代培養子宮肌瘤細胞和正常子宮平滑肌細胞并鑒定。取第3代子宮肌瘤細胞(實驗組)和正常平滑肌細胞(對照組)，采用Western blotting法檢測細胞中的PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白，分析PR-M、PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達的相關性。結果 實驗組細胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白相對表達量分別為0.130±0.012、0.432±0.052、0.456±0.045、0.525±0.082，對照組分別為0.086±0.015、0.223±0.036、0.269±0.026、0.202±0.034，實驗組細胞中PR-M、PR-A、PR-B蛋白和porin蛋白相對表達量均高于對照組(P均<0.01)。實驗組中PR-M蛋白與porin蛋白相對表達量呈正相關關系(r=0.464，P<0.05)。結論 子宮肌瘤細胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白表達升高，PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白表達異常可能與子宮肌瘤的發病有關，且PR-M蛋白與porin蛋白可能在子宮肌瘤發病中起協同作用。

子宮肌瘤；子宮肌瘤細胞；孕激素受體M；孕激素受體A；孕激素受體B；porin蛋白

子宮肌瘤發病率呈逐年上升趨勢，是臨床子宮切除的主要原因，其病因病機仍未明確。孕激素受體M(PR-M)是2003年發現的定位于核外線粒體的孕激素受體[1]，研究發現孕激素可誘導PR-M使線粒體膜電位增加，抑制乳腺癌細胞、原代及永生化子宮平滑肌細胞凋亡[2，3]。我們前期研究發現PR-M、孕激素受體A(PR-A)和孕激素受體(PR-B)在子宮肌瘤組織中的表達量均顯著高于瘤旁正常子宮平滑肌組織，提示PR-M在子宮肌瘤生長過程中發揮促進作用。porin是參與形成線粒體外膜小孔的線粒體標志性蛋白，可誘導細胞代謝與凋亡[4,5]。本研究分離培養原代子宮平滑肌瘤細胞和正常子宮平滑肌細胞，觀察了子宮肌瘤細胞中PR-M、PR-A、PR-B與porin的表達變化，現在報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織與材料 子宮肌瘤組織和相應瘤旁組織來自行子宮肌瘤切除術的子宮肌瘤患者(20例)，患者年齡33～50歲。術中留取組織后立即置于4 ℃含雙抗的DMEM培養基中，冰上盡快運回實驗室進行處理。所有患者均無其他性激素相關合并癥，術前至少6個月內未服用類固醇激素。組織標本均經病理檢查證實，標本收集均經患者知情同意。DMEM、DMEM-F12培養基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA、PBS、Ⅰ型膠原酶(索萊寶公司)，SP試劑盒、DAP染色試劑盒(北京中山金橋公司)，一抗β-actin、一抗Anti-smooth muscle Actin antiboby、線粒體porin蛋白(武漢三鷹生物科技有限公司)，一抗c-19(抗PR抗體，Santa Cruz公司)。

1.2 子宮肌瘤細胞及子宮平滑肌細胞的分離、培養與鑒定 參照文獻[6]方法并加以改良。分別將子宮肌瘤組織塊和瘤旁正常子宮平滑肌組織塊放入含雙抗PBS液的無菌培養皿中浸泡3～5 min,漂洗3 次，將組織塊盡量剪碎，向管中加入0.2% Ⅰ型膠原酶，在37 ℃水浴消化2～3 h，1 000 r/min離心10 min后棄上清，加入10%完全培養基接種細胞于培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中進行孵育培養。培養24 h待細胞貼壁進行第1次換液，以后每2～3天換液1次，待細胞融合達80%時用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。傳至第三代細胞時在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，免疫組化染色進行鑒定。細胞呈長梭形或不規則，細胞一般呈放射狀生長，4 d左右細胞生長數量有明顯增加，7～10 d細胞數量達高峰，密集處多呈旋渦狀生長，并出現層疊排列及典型的“峰-谷”樣現象(見圖1)，經免疫組化檢查鑒定為子宮肌瘤細胞。子宮平滑肌細胞分離培養、傳代參考上述方法，細胞形態見圖1。

注：A為200倍鏡下子宮肌瘤細胞形態；B為200倍鏡下子宮平滑肌細胞形態。

1.3 PR-M、PR-A/B、porin蛋白檢測 采用Western blotting法。取第3代子宮肌瘤細胞(實驗組)和正常平滑肌細胞(對照組)分別接種于6孔板中，培養細胞融合至80%～90%時，提取細胞總蛋白，按25 μg/孔進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白質電轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗3次，加入1∶800稀釋的PR兔源多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜，加入1∶4 000稀釋的紅色熒光標記的羊抗兔IgG，室溫反應2 h，TBST漂洗，Odyssey雙色紅外熒光成像系統掃描結果并分析，以目的蛋白蛋白條帶灰度值與β-actin內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

實驗組細胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白相對表達量分別為0.130±0.012、0.432±0.052、0.456±0.045、0.525±0.082，對照組分別為0.086±0.015、0.223±0.036、0.269±0.026、0.202±0.034，實驗組細胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白相對表達量均高于對照組(P均<0.01)。見圖2。實驗組中PR-M蛋白與porin蛋白相對表達量呈正相關關系(r=0.464，P<0.05)，實驗組中PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達無關性(r分別為0.340、0.052，P均>0.05)。對照組中PR-M、PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達均無相關性(r分別為0.078、0.199和-0.262，P均>0.05)。

3 討論

體外培養的子宮肌瘤細胞是研究子宮肌瘤發病機制和藥物篩選的理想材料，可有效控制相關實驗條件，重復性強且節省實驗用藥和實驗試劑。但由于子宮肌瘤并非惡性腫瘤，缺少無限增殖的特性，高純度且生長狀態穩定的肌瘤細胞的提取與培養是一個難題。另外，原代培養細胞容易污染且不易存活，傳代后細胞狀態及性狀變化也加大了原代培養的難度及實驗細胞的均一性。本研究參考文獻[6]方法，并根據實驗室條件加以改良和優化，提高了細胞提取率、細胞純度及細胞數量，便于進行下一步實驗。

注：A為對照組；B為實驗組。

PR屬于配體激活核轉錄因子超家族成員。傳統PR主要是指PR-A 和PR-B，兩者主要分布于胞核和胞質。PR-M是2002年從人主動脈細胞和脂肪組織cDNA文庫克隆到的，PR-M存在于線粒體外膜，孕激素可通過與PR-M結合使平滑肌細胞線粒體膜電位(MMP)升高，此過程沒有蛋白質合成，孕激素可能通過PR-M發揮非基因組效應(孕激素可不依賴孕激素核受體的轉錄活性產生快速調節作用)，使細胞呼吸加強，能量代謝增加，抑制細胞凋亡最終導致細胞異常增殖。PR-M是目前發現的惟一直接參與孕激素的非基因組效應的類固醇激素受體亞型[7]。多項研究[8，9]顯示PR-M在子宮肌瘤組織中的表達量較正常肌層組織中升高。研究[10]表明，PR-M在孕激素誘導下參與細胞存活和增殖的能量供給。有學者[11]提出PR能直接激活信號通路，引起子宮肌瘤細胞增殖永生化，證明孕激素能增加線粒體膜電位且這一作用可被PR拮抗劑所抑制。Su等[12]發現雌孕激素可以通過一些生長因子介導的自分泌或旁分泌的方式作用于子宮肌瘤細胞，刺激細胞分裂及增殖；該學者還認為，雌孕激素與表皮生長因子及其受體之間可能互為調控，共同影響子宮肌瘤的發生[13]。以上研究均證實孕激素可通過其相應受體參與子宮肌瘤的發生發展。線粒體外膜孔蛋白porin定位于線粒體外膜，組成線粒體外膜小孔蛋白的主要部分，其功能與MMP相關[14]。研究表明，子宮肌瘤細胞中porin 表達顯著高于正常平滑肌細胞，提示肌瘤細胞線粒體功能較鄰近平滑肌細胞活躍。孕激素非基因組作用的機制尚未明確。研究[15]表明孕激素可能通過直接與經典細胞內膜結合受體發揮作用。傳統觀點認為，孕激素PR-B和PR-A發揮調節基因表達的功能[16]。然而，近幾十年來，學者們發現孕激素具有獨立于基因調控外的作用。這些功能基于孕激素誘導的細胞事件，它們發生過于迅速，涉及基因轉錄或缺乏活躍的基因轉錄，如精子成熟。以往這種“非基因組作用”的特異性受體尚不明確[17]。有學者[18,19]發現了一種線粒體孕激素受體PR-M,開啟了直接的線粒體活性配體依賴性調節的可能性。

本研究觀察了原代培養的子宮肌瘤細胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白的表達變化，結果顯示，實驗組細胞中PR-M、PR-A、PR-B蛋白和porin蛋白相對表達量均高于對照組；進一步分析顯示，實驗組中PR-M蛋白與porin蛋白相對表達量呈正相關關系而PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達無關，對照組PR-M、PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白均無相關性，與先前文獻報道的結果一致[20]。上述結果提示，PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白表達異常可能與子宮肌瘤的發病有關，且PR-M蛋白與porin蛋白可能在子宮肌瘤發病中起協同作用，但其具體通過何種途徑或方式還有待進一步研究。

[1] Saner KJ, Welter BH, Zhang F, et al. Cloning and expression of a novel, truncated, progesterone receptor[J]. Mol Cell Endocrinol, 2003,200(1-2):155-163.

[2] Behera MA, Dai Q, Garde R, et al. Progesterone stimulates mitochondrial activity with subsequent inhibition of apoptosis in MCF-10A benign breast epithelial cells[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2009,297(5):E1089-E1096.

[3] Lee KL, Dai Q, Hansen EL, et al. Modulation of ATP-induced calcium signaling by progesterone in T47D-Y breast cancer cells[J]. Mol Cell Endocrinol, 2010,319(1-2):109-115.

[4] Rapizzi E, Pinton P, Szabadkai G, et al. Recombinant expression of the voltage-dependent anion channel enhances the transfer of Ca2+microdomains to mitochondria[J]. J Cell Biol, 2002,159(4):613-624.

[5] 封全靈,劉弘揚.孕激素受體和線粒porin蛋白在子宮肌瘤組織中的表達[J].現代婦產科進展,2013,22(11):897-899.

[6] 韓虹娟,李冬華,錢睿亞,等.人子宮肌瘤細胞原代培養方法的比較研究[J].中國婦幼保健,2014,29(22):3656-3659.

[7] Price TM, Dai Q. The Role of a Mitochondrial Progesterone Receptor (PR-M) in Progesterone Action[J]. Semin Reprod Med, 2015, 33(3): 185-194.

[8] Young MJ, Bay DC, Hausner G, et al. The evolutionary history of mitochondrial porins[J]. BMC Evol Biol, 2007,7(1):31.

[9] Shoshan-Barmatz V, De Pinto V, Zweckstetter M, et al. VDAC，a multi-functional mitochondrial protein regulating cell life and death[J]. Mol Aspects Med, 2010,31(3):227-285.

[10] Feng Q, Crochet JR, Dai Q, et al. Expression of a mitochondrial progesterone receptor(PR-M) in leiomyomata and association with increased mitochondrial membrane potential[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2014,99(3):390-399.

[11] Kim JJ, Sefton EC. The role of progesterone signaling in the pathogenesis of uterine leiomyoma[J]. Mol Cell Endocrinol, 2012,358(2):223-231.

[12] Su C, Fan M, Lu L, et al. Role of epidermal growth factor in pathogenesis of uterine leiomyomas[J]. Asian Pac J Trop Med, 2015,8(5):378-381.

[13]王立群,趙靜,張麗芬.子宮肌瘤中表皮細胞生長因子受體變化及其與雌激素和孕激素受體的關系[J].中國全科醫學,2010,(21):2391-2393.

[14] 封全靈,劉弘揚.子宮平滑肌瘤組織中孕激素受體和porin mRNA的表達[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,1:116-119.

[15] 封全靈,王智霆,熊禎禎,等.孕激素對PR-M陽性原代子宮肌瘤細胞增殖和凋亡影響[J].現代婦產科進展,2017,26(1):55-57+60.

[16] Tantibhedhyangkul J, Hawkins KC, Dai Q, et al. Expression of a mitochondrial progesterone receptor in human spermatozoa correlates with a progestin-dependent increase in mitochondrial membrane potential[J]. Andrology, 2014,2(6):875-883.

[17]封全靈,熊禎禎,王智霆,等.米非司酮對孕激素受體M陽性子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響[J].山東醫藥,2017,57(3):13-15.

[18] Cuevas CA, Tapia-Pizarro A, Salvatierra AM, et al. Effect of single post-ovulatory administration of mifepristone (RU486) on transcript profile during the receptive period in human endometrium[J]. Reproduction, 2016,151(4):331-349.

[19] Price TM, Dai Q. The Role of a Mitochondrial Progesterone Receptor (PR-M) in Progesterone Action[J]. Semin Reprod Med, 2015,33(3):185-194.

[20] Dai Q, Shah AA, Garde RV, et al. A truncated progesterone receptor (PR-M) localizes to the mitochondrion and controls cellular respiration[J]. Mol Endocrinol, 2013,27(5):741-753.

河南省高等學校重點科研項目計劃(16A320047)。

封全靈(E-mail: 614992855@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.012

R711.74

A

1002-266X(2017)15-0045-03

2016-08-29)