帕金森病細胞模型的構建及氨基酸表達觀察

李雙，李雙雙，張曉瑩，郭春燕，王治寶

(河北北方學院，河北張家口075000)

帕金森病細胞模型的構建及氨基酸表達觀察

李雙，李雙雙，張曉瑩，郭春燕，王治寶

(河北北方學院，河北張家口075000)

目的 建立帕金森病(PD)人神經母細胞瘤細胞模型，并篩選PD細胞中的氨基酸標志物。方法 將人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y分為正常組、溶媒組、魚藤酮組。魚藤酮組分別加入0.15、0.25 μmol/L的魚藤酮，溶媒組加入二甲基亞砜(DMSO)，正常組不加藥物。分別于給藥24、48 h后采用MTT法測算細胞存活率，倒置顯微鏡觀察細胞形態，選擇對細胞存活、形態影響較小的魚藤酮作用濃度及作用時間(0.15 μmol/L、24 h)，采用Western blotting法檢測SH-SY5Y細胞中的α-突觸核蛋白以驗證PD模型。采用高效液相色譜法檢測PD細胞中的谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)，對魚藤酮組和溶媒組差異有統計學意義的氨基酸進入偏最小二乘判別分析，選擇P<0.05且變量重要性投影值(VIP)>1的氨基酸為PD的標志物。結果 魚藤酮組細胞中α-突觸核蛋白相對表達量高于溶媒組(P均<0.05)，表明SH-SY5Y細胞PD模型制作成功。給藥24 h時，魚藤酮組細胞中Glu、Ser、Gln、His、Gly、Pro、Phe、Ile、Leu、Lys水平低于溶媒組(P均<0.05)；給藥48 h時，魚藤酮組除Gln外，其余11種氨基酸水平均低于溶媒組(P均<0.05)。篩選氨基酸標志物為Glu、Ser、Gly、Pro(給藥24 h時VIP值分別為1.016、1.016、1.016、1.009,給藥48 h時VIP值均為1.001)。結論 利用魚藤酮誘導成功建立了PD細胞模型，篩選出Glu、Ser、Gly、Pro可能為PD的潛在標志物。

帕金森病；魚藤酮；人神經母細胞瘤細胞；氨基酸

帕金森病(PD)是最常見的神經退行性疾病之一，嚴重威脅人類健康和生活質量[1～3]。大量研究表明經常接觸工農業毒性物質的人群患PD的風險較大。魚藤酮是一種廣泛使用的天然殺蟲劑，研究[4，5]證實與其接觸可引起PD。α-突觸核蛋白的聚集與PD發病和相關功能障礙密切相關[6，7]。目前PD初期有少量對癥治療方法，但尚無病因治療方法，中后期PD的治療方法仍在探尋中[8，9]。故PD的早期診斷對有效治療和提高患者生活質量有重要意義。已有文獻[9～12]報道了興奮性氨基酸變化在PD發病過程可能發揮作用。已知與神經系統結構和功能發揮重要作用的必需氨基酸有賴氨酸(Lys，K)、色氨酸(Trp，W)、苯丙氨酸(Phe，F)、異亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)，非必需氨基酸有組氨酸(His，H)、谷氨酸(Glu，E)、絲氨酸(Ser，S)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、脯氨酸(Pro，P)[13～17]，而在PD的發生和發展過程中上述氨基酸發生了怎樣的變化，能否作為PD診斷的潛在標志物仍有待研究。為此，我們采用魚藤酮誘導建立了PD人神經母細胞瘤細胞模型，觀察PD模型中上述12種氨基酸的代謝變化，以篩選有望作為PD標志物的氨基酸，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。DMEM/F-12培養基、磷酸鹽緩沖液干粉(PBS固體)、0.25%胰蛋白酶溶液、胎牛血清(FBS)、噻唑藍(MTT)、魚藤酮、兔抗α-突觸核蛋白、色譜純甲醇、乙腈。Glu、Ser、Gln、His,、Gly、Ala、Pro、Trp、Phe、Ile、Leu、Lys標準品純度均>98%。2,4-二硝基氟苯(DNFB)、碳酸氫鈉、無水乙酸鈉，生理鹽水。CO2細胞培養孵箱，分析天平，sigma3K30超速離心機，HH-4恒溫水浴箱，SW-CJ-1FD超凈工作臺，WH-2旋渦振蕩器，ECLIPSE Ti-U倒置熒光顯微鏡，XDS-1B光學顯微鏡，美國waters e2695高效液相色譜儀，自動進樣器、柱溫箱及色譜數據處理系統，waters2998二極管陣列檢測器。

1.2 PD細胞模型的建立 SH-SY5Y細胞在含10%胎牛血清DMEM/F12培養液中，于37 ℃飽和濕度、5% CO2條件下培養。取對數生長期細胞進行實驗。將細胞分為正常組、溶媒組、魚藤酮組。消化細胞配制成密度為6×104/mL的細胞懸液，種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，每組6個復孔，當細胞貼壁、匯合度達70%～80%時，魚藤酮組分別加入終濃度為0.15、0.25 μmol/L的魚藤酮；溶媒組加入終濃度為0.012 5%的DMSO，正常組不加藥物。分別于給藥24、48 h后采用MTT法測算細胞存活率，倒置顯微鏡觀察細胞形態。給藥24、48 h魚藤酮組細胞存活率低于正常組和溶媒組，且魚藤酮0.25 μmol/L亞組細胞存活率低于0.15 μmol/L亞組(P均<0.05)；給藥48 h魚藤酮組細胞存活率低于給藥24 h時(P均<0.05)。正常組與溶媒組細胞形態無顯著性變化，魚藤酮組與溶媒組相比，細胞皺縮、變圓，體積變小，排列松散；其中0.25 μmol/L亞組較0.15 μmol/L亞組存活細胞數量更少，大多數細胞漂浮(見圖1)。選擇對細胞存活、形態影響較小的魚藤酮作用濃度0.15 μmol/L、作用時間24 h。采用Western blotting法檢測SH-SY5Y細胞中的α-突觸核蛋白驗證PD模型制作情況。α-突觸核蛋白表達顯著升高判定為模型制作成功。目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/內參蛋白光密度值。

1.3 PD模型細胞中氨基酸標志物的篩選

1.3.1 PD細胞中氨基酸檢測 采用高效液相色譜法。①氨基酸的衍生化：參照文獻[18]方法，采用DNFB柱前衍生化法進行細胞中氨基酸衍生化。②液相色譜條件：色譜柱為Thermo BDS Hypersil(5 μm，4.6 mm×250 mm)，檢測波長360 nm，體積流量1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流動相為甲醇-水(0.1 mol/L乙酸鈉)；梯度洗脫條件為15%甲醇0～10 min，15%～42%甲醇10～15 min，42%～51%甲醇15～18 min，65%甲醇18～26 min，維持5 min。③線性范圍的考察：配制12種氨基酸標準系列溶液，以氨基酸峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，得到12種氨基酸的回歸方程。④系統適應性試驗：在上述色譜條件下，連續進樣氨基酸標準品混合物，計算氨基酸峰面積的日內精密度；連續進樣5 d，計算日間精密度；取已知含量的樣品，分別加入高、中、低三個濃度的氨基酸對照品儲備液，每個濃度平行3份，測定峰面積，代入回歸方程，計算氨基酸含量和各種氨基酸的回收率。樣品含量測定：分別于適宜濃度的魚藤酮作用細胞24、48 h后收集細胞，DNFB柱前衍生化，在上述色譜條件下進樣10 μL，記錄色譜圖，將峰面積帶入回歸方程計算細胞內氨基酸水平，并與溶媒組進行比較。

注：A、B、C、D分別為給藥24 h正常組、溶媒組、魚藤酮0.15 μmol/L亞組、魚藤酮0.25 μmol/L亞組細胞形態；E、F、G、H分別為給藥48 h正常組、溶媒組、魚藤酮0.15 μmol/L亞組、魚藤酮0.25 μmol/L亞組細胞形態。

1.3.2 統計分析 采用SPSS18.0軟件。組間比較采用單因素方差分析。對魚藤酮組和溶媒組差異有統計學意義的氨基酸再應用SIMCA-P+11軟件進行偏最小二乘分析法(PLS-DA)分析，以P<0.05且變量重要性投影值(VIP)>1判定為PD模型的氨基酸標志物。

2 結果

2.1 PD細胞模型建立情況 溶媒組和魚藤酮組細胞中α-突觸核蛋白相對表達量分別為0.23和0.47，魚藤酮組細胞中α-突觸核蛋白相對表達量高于溶媒組(P均<0.05)，表明SH-SY5Y細胞PD模型制作成功。

2.2 PD細胞模型中氨基酸標志物的篩選結果 Glu、Ser、Gln、His、Gly、Ala、Pro、Trp、Phe、Ile、Leu、Lys回歸方程分別為y=3.98x+9.32、y=6.26x+8.06、y=4.87x+8.38、y=4.66x+1.79、y=12.17x+4.59、y=7.14x+21.03、y=9.50x+3.98、y=13.90x+3.21、y=6.28x+3.01、y=6.47x+4.65、y=6.04x+4.94、y=6.98x+6.45，相關系數r>0.988 7，所試濃度范圍內線性關系良好。12種氨基酸日內、日間精密度良好，RSD均小于2.5%。在實驗色譜條件下各氨基酸分離良好(圖2)。12種氨基酸的平均回收率在90%～105%，RSD<3.6%，方法回收率良好。給藥24 h時，魚藤酮組10種氨基酸(Glu、Ser、Gln、His、Gly、Pro、Phe、Ile、Leu、Lys)水平低于溶媒組(P均<0.05)；給藥48 h時，除Gln外，其余11種氨基酸水平均低于溶媒組(P均<0.05)。見表1。應用SIMCA-P+11軟件分析得出氨基酸得分圖與載荷圖(圖3)，選取遠離原點且VIP>1的氨基酸為標志物，分別為Glu、Ser、Gly、Pro(給藥24 h時VIP值分別為1.016、1.016、1.016、1.009，給藥48 h時VIP值均為1.001)。

注：A為標準品色譜圖；B為細胞中氨基酸色譜圖；C為衍生試劑及衍生化副產物色譜圖。

3 討論

魚藤酮具有極強的親脂性，能透過血腦屏障和細胞膜，魚藤酮模型不僅能復制PD的行為學改變，而且能再現人類PD的病理學特征。人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y具有神經突樣的細胞質突起，可以表達多巴胺-β 羥化酶、α-突觸核蛋白，被廣泛用于PD模型的建立。所以，我們選擇魚藤酮作用于SH-SY5Y細胞誘導PD模型。目前PD確切的發病機制尚不清楚，公認的臨床病理特征有黑質紋狀體多巴胺功能障礙、紋狀體α-突觸核蛋白聚集。本研究結果顯示，魚藤酮可使SH-SY5Y細胞存活率下降、細胞固縮、α-突觸核蛋白表達增高，且作用呈濃度、時間依賴性，選擇對細胞存活、形態影響較小的魚藤酮作用濃度0.15 μmol/L、作用時間24 h，魚藤酮組細胞中α-突觸核蛋白相對表達量高于溶媒組，成功建立了SH-SY5Y細胞PD模型。

表1 魚藤酮組與溶媒組細胞中12種氨基酸水平比較

注：與相同給藥時間溶媒組相比，▲P<0.01。

注：A、C為得分圖；B、D為載荷圖；得分圖中每個點代表一個樣本；從圖A、C可見，溶媒組和魚藤酮組區分明顯，說明魚藤酮作用細胞后，細胞內氨基酸的表達有了較明顯的變化；在載荷圖B、D中，每點代表一個氨基酸變量，離原點距離較遠的點可能為標志物，進一步通過VIP值確定為標志物。

氨基酸是細胞中蛋白合成的生物底物，氨基酸的吸收、轉運、代謝對生物體生長發育至關重要。神經系統中存在著大量的游離氨基酸，參與神經系統的代謝、神經興奮及抑制調節[19]。其中，Glu和Gly是重要的氨基酸遞質[13]；Glu、Gln、Gly、Ala、Ser、His、Trp在谷氨酰胺合成酶反饋抑制系統中起關鍵作用；谷氨酸-谷氨酰胺循環是星形膠質細胞和神經元代謝耦聯最重要的途徑之一[14]；Gly、Ser、His、Trp代謝是一碳單位的重要來源；Leu及其異構體Ile是最重要的支鏈氨基酸；Pro、Phe、Lys在細胞氧化應激反應中發揮重要作用[15]。Lys對人中樞神經和周圍神經系統均起重要作用，在mTORC1信號通路中也發揮重要作用[16]。基于上述理論，我們選取了12種氨基酸作為待測指標。

代謝組學主要考察生物體系受擾動或損傷后內源性代謝物的變化[20，21]，統計分析方法包括主成分分析、聚類分析、顯著性分析和PLS-DA[22]。PLS-DA是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，可同時實現多元線性回歸、主成分分析及兩組變量間的典型相關分析，是代謝組學中最常規的方法。我們首先對魚藤酮組和溶媒組細胞中12種氨基酸水平進行比較，對差異有統計學意義的氨基酸進行PLS-DA，以VIP>1為依據[23]，篩選出4種氨基酸生物標志物(Glu、Ser、Gly、Pro)。

Glu是主要的興奮性神經遞質，以往研究[24]發現慢性應激性抑郁發生時Glu水平顯著升高。Glu的聚集具有神經毒性[25]，是神經性疾病發生的誘因之一。而本實驗結果顯示，PD細胞中Glu水平顯著下降，由此可認為Glu水平變化并不是誘發PD的原因，而是PD發生后機體細胞做出應激的結果，提示Glu可作為評估PD進程的氨基酸標志物[26]。除Glu聚集會誘發神經毒性外，未見其他氨基酸神經毒性的報道，可認為PD體外細胞模型內其他氨基酸水平變化也是疾病發生后引起的機體應激反應所致。Ser是N-甲基-D天冬氨酸發揮其神經傳遞作用的激動劑，Gly可抑制神經細胞過度興奮[27，28]，Pro的初級代謝為氧化應激反應必不可少的過程[29，30]，這三種氨基酸會隨著細胞氧化應激反應的增強而代謝加速[31]。另外Glu、Ser、Gly同為谷氨酰胺合成酶反饋抑制系統的關鍵氨基酸，均可在一定情況下參與Gln的轉化。在PD細胞中，為防止興奮性氨基酸Glu的聚集造成進一步神經損傷，Glu轉化為Gln的速度加快，同時帶動此反饋抑制系統中的Ser、Gly代謝轉化加快，致使Gln水平隨著損傷加重下降程度降低，甚至超過正常水平。

總之，魚藤酮可引起SH-SY5Y細胞損傷，誘導PD模型；利用PLS-DA技術篩選得到Glu、Ser、Gly、Pro為PD的潛在標志物。本研究結果為PD的早期診斷提供了新思路和新方法。

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Construction of Parkinson 's disease cell model and observation of amino acid expression

LIShuang,LIShuangshuang,ZHANGXiaoying,GUOChunyan,WANGZhibao

(HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China)

Objective To establish the human neuroblastoma cell model with Parkinson's disease (PD), and screen out the amino acid biomarkers in PD cells. Methods Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were divided into the normal group, solvent group and rotenone group. Cells in the rotenone group were given 0.15, 0.25 μmol/L rotenone, cells in the solvent group were given dimethyl sulfoxide (DMSO), and the normal group was not added with any drug. Cell viability was assessed by MTT assay at 24, 48 h after medication, and inverted microscope was used to observe the cell morphology. Then we determined the concentration (0.15 μmol/L) and treatment time (24 h) of rotenone which had the little effect according to the changes of cell viability and cell morphology. The expression of α-synuclein was detected by Western blot to validate the success of PD model. And 12 kinds of amino acids, including glutamic acid (Glu), serine (Ser), glutamine (Gln), histidine (His), glycine (Gly), alanine (Ala), proline (Pro), tryptophan (Trp ), phenylalanine (Phe), isoleucine (Ile), leucine (Leu), and lysine (Lys), in PD cells were determined by high performance liquid chromatography, and we analyzed the significant changed amino acids between solvent group and rotenone group with partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). Amino acid biomarkers in the PD model were determined with a variable importance in the projection (VIP) value greater than 1 and a P value less than 0.05. Results The expression of α-synuclein in the cells of the rotenone group was significantly higher than that of the solvent group (P<0.05), indicating the successful construction of SH-SY5Y cell model with PD. At 24 h, the Glu, Ser, Gln, His, Gly, Pro, Phe, Ile, Leu, Lys levels in the rotenone group were lower than those in the solvent group (allP<0.05). At 48 h, the levels of 11 kinds of amino acid except Gln in the rotenone group were lower than those in the solvent group (allP<0.05). Glu, Ser, Gly, Pro were screened out as the amino acid biomarkers (At 24 h, VIP values were 1.016, 1.016, 1.016, 1.009; at 48 h, all VIP values were 1.001). Conclusion The PD cell model is successfully established by rotenone induction and Glu, Ser, Gly, and Pro may be the potential diagnostic biomarkers for PD.

Parkinson's disease; rotenone; human neuroblastoma cells; amino acid

河北省教育廳重大項目(ZD2014075)；河北北方學院博士科研啟動基金項目。

李雙(1994-)，女，本科，主要研究方向為藥物制劑。E-mail: 1037881424@qq.com

郭春燕(1968-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要研究方向為神經藥理學、藥物分析。E-mail: guochy0311@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.006

R742.5

A

1002-266X(2017)15-0021-05

2016-12-17)