裂果薯總皂苷對人肝癌細胞增殖、遷移、凋亡的影響及對正常肝細胞的毒性作用

邱漢琛，孫悅文，羅舜仁，陳燕燕，付麗香，廖智紅，黃修影，劉布鳴，唐安洲，梁鋼

(1廣西醫科大學藥學院，南寧530021；2柳州市婦幼保健院；3廣西中藥質量標準研究重點實驗室；4廣西醫科大學第一附屬醫院)

·論著·

裂果薯總皂苷對人肝癌細胞增殖、遷移、凋亡的影響及對正常肝細胞的毒性作用

邱漢琛1，孫悅文1，羅舜仁1，陳燕燕1，付麗香2，廖智紅1，黃修影1，劉布鳴3，唐安洲4，梁鋼1

(1廣西醫科大學藥學院，南寧530021；2柳州市婦幼保健院；3廣西中藥質量標準研究重點實驗室；4廣西醫科大學第一附屬醫院)

目的 觀察裂果薯總皂苷(SFSP)對人肝癌細胞株SMMC-7721增殖、遷移、凋亡的影響及對人正常肝細胞HL-7702的毒性作用。方法 取對數生長期的SMMC-7721細胞，分為給藥組和對照組(不加SFSP),給藥組分別加入0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的SFSP培養24 h，采用MTT法觀察并計算細胞增殖抑制率和IC50；分別以0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細胞，分別于培養24、48 h采用劃痕實驗觀察細胞遷移能力變化；分別以0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細胞，培養24 h后采用吖啶橙/溴乙雙熒光染色法觀察SMMC-7721細胞凋亡情況，免疫熒光法觀察細胞形態。取對數生長期的HL-7702細胞，分別加入0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL的SFSP，測算細胞增殖抑制率及IC50。結果 0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細胞24、48、72 h后，細胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用呈現時間與劑量依賴性(P均<0.05)；SFSP在24、48、72 h時的IC50值分別為3.75、1.56、0.95 μg/mL。0、2、4、6 μg/ mL的SFSP作用于SMMC-7721細胞后，細胞劃痕愈合率逐漸減小，凋亡細胞逐漸增多(P均<0.05)。SFSP作用后，SMMC-7721細胞出現皺縮，呈圓形或紡錘形，微管蛋白β熒光強度降低并高度聚集，觀察到大量阻滯于分裂周期中的細胞。0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL的SFSP作用于HL-7702細胞后，細胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP作用24 h的IC50為47.6 μg/mL，低于作用于SMMC-7721細胞24 h時的IC50(3.75 μg/mL)。結論 SFSP可抑制SMMC-7721細胞增殖與遷移，誘導其凋亡，阻滯其細胞周期，且對正常肝細胞毒性作用較小。

裂果薯；總皂苷；肝癌；細胞增殖；細胞遷移；細胞凋亡

裂果薯別名屈頭雞、水狗仔、水田七及水蘿卜等，為蒟蒻薯科裂果薯屬植物，其是廣西一種特色中草藥，藥用其根塊莖，具有清熱解毒、散瘀消腫、理氣止痛等功效[1]；瑤族人民用于無名腫痛和抗腫瘤治療[2]。本課題組前期研究從29種廣西民間抗腫瘤中草藥提取物和含藥血清進行篩選，首次發現裂果薯醇提物和皂苷成分具有明顯抑制人肝癌細胞和鼻咽癌細胞增殖的作用[3，4]，裂果薯醇提取物具有抑制人肝癌裸鼠移植瘤生長與血管生成的作用[5]。但目前國內外仍未有裂果薯總皂苷(SFSP)對人肝癌細胞株SMMC-7721作用的相關報道，為此，本研究觀察了SFSP對SMMC-7721細胞增殖、遷移和凋亡的影響及對人正常肝細胞HL-7702的毒性作用，為新藥研發奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 裂果薯塊莖購自廣西壯族自治區資源縣瓜里鄉，由廣西壯族自治區中醫藥研究院黃云峰教授鑒定并出具報告。SFSP皂苷含量為85.31%。SMMC-7721細胞和HL-7702細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM高糖培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Hyclone公司。MTT購自AMRESCO公司。4%多聚甲醛溶液和AO-EB試劑盒購自碧云天公司。抗熒光淬滅封片液購自南京凱基公司。小鼠抗人微管蛋白β單克隆抗體和羊抗小鼠FITC二抗購自Abcam公司。

1.2 SFSP對SMMC-7721細胞增殖的影響觀察 取對數生長期的SMMC-7721細胞以1×105/mL接種于96孔板，分為給藥組和對照組。培養箱培養24 h后棄培養基，給藥組分別加入含有0.625、1.25、2.5、5 μg/mL SFSP的培養液200 μL。對照組不加SFSP。孵育24 h后移除培養液，加入含0.5 mg/mL的MTT的DMEM培養液200 μL孵育4 h。4 h后棄去培養基，每孔加入DMSO 150 μL，15 min內用酶標儀在490 nm波長處測吸光度值(A值)。細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-給藥組A值)/對照組A值×100%。使用SPSS軟件回歸分析計算IC50。

1.3 SFSP對SMMC-7721細胞遷移的影響觀察 取對數生長期的SMMC-7721細胞，以2.5×105/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養箱培養24 h，細胞增長至90%融合度時，以移液槍無菌槍頭垂直在96孔板的中央劃一條痕跡，用PBS洗滌3次后，分別加入含0、2、4、6 μg/mL SFSP的無血清DMEM培養基。分別在劃痕后0、24、48 h在固定位置用倒置顯微鏡拍照，以劃痕愈合率評價細胞遷移能力。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h或48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.4 SFSP對SMMC-7721細胞凋亡的影響觀察 取對數生長期的SMMC-7721細胞，以3×105/mL接種于6孔板，每孔1 mL,培養箱培養24 h后，棄去培養基，分別加入0、2、4、6 μg/mL的SFSP。孵育24 h后，以PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min；PBS清洗3次，分別加入吖啶橙(AO)/溴乙(EB)染色液0.5 mL，避光孵育5 min；PBS清洗細胞3次，用含有抗熒光淬滅劑的封片液封閉細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況并拍照。隨機選取5個視野統計各濃度組正常細胞和凋亡細胞的數量，并計算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.5 SFSP對SMMC-7721細胞形態的影響觀察 采用免疫熒光法。取對數生長期的SMMC-7721細胞，以3×105/mL接種于6孔板，每孔1 mL,培養箱培養24 h后，分別加入0、2、4、6 μg/mL的SFSP。孵育24 h后，以冰PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min；PBS清洗3次，在室溫下以0.5% Triton X-100通透15 min；PBS清洗3次，以山羊血清室溫封閉30 min；棄去血清，以小鼠抗人微管蛋白β抗體(1∶1 000)在4 ℃冰箱中孵育過夜；PBST清洗3次，吸干后加入FITC羊抗小鼠(1∶500)二抗，室溫避光孵育1 h，之后PBST避光清洗3次；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST清洗；用含有抗熒光淬滅劑的封片液覆蓋細胞，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 SFSP對HL-7702細胞的毒性作用觀察 取對數生長期的HL-7702細胞，以1×105/mL接種于96孔板，每孔100 μL,培養箱培養24 h后棄培養基，分別加入含0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL SFSP的培養液，每孔200 μL。參考“1.2”中的方法測算細胞增殖抑制率及IC50。

2 結果

2.1 SFSP對SMMC-7721細胞增殖的影響 0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細胞24、48、72 h后，細胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用呈現時間與劑量依賴性(P均<0.05)。詳見表1。SFSP在24、48、72 h時的IC50值分別為3.75、1.56、0.95 μg/mL。

表1 SFSP作用不同時間后給藥組SMMC-7721細胞增殖抑制率變化

2.2 SFSP對SMMC-7721細胞遷移的影響 0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細胞24 h后劃痕愈合率分別為32.23%±0.67%、27.82%±0.98%、13.39%±1.23%、10.78%±1.25%；作用48 h后分別為62.81%±0.86%、53.34%±1.32%、33.07%±1.63%、12.46%±1.74%。隨著SFSP作用濃度增大，SMMC-7721細胞劃痕愈合率減小(P均<0.05)。見圖1。

2.3 SFSP對SMMC-7721細胞凋亡的影響 AO/EB染色后正常細胞淡綠色熒光；早期凋亡細胞局部呈現明亮的綠色熒光或黃綠色熒光；晚期凋亡細胞呈現橙黃色熒光或橘黃色熒光；壞死細胞呈現不均勻的橘黃色熒光。0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細胞后，細胞凋亡率分別為0、12.34%±2.56%、43.87%±4.21%、90.46%±3.57%，不同濃度組相比，P均<0.05。見圖2。

圖1 不同濃度SFSP作用于SMMC-7721細胞24、48 h后劃痕愈合情況

圖2 不同濃度SFSP作用后SMMC-7721細胞凋亡情況

2.4 SFSP對SMMC-7721細胞形態的影響 未添加SFSP的SMMC-7721細胞呈伸展伴有觸角的多邊形狀，細胞核呈規則的橢圓形，微管蛋白β均勻分布于胞質。不同濃度SFSP作用后，細胞出現皺縮，呈現圓形或紡錘形，微管蛋白β熒光強度降低并高度聚集，觀察到大量阻滯于分裂周期中的細胞。

2.5 SFSP對HL-7702細胞的毒性作用 0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL的SFSP作用于HL-7702細胞后，細胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP作用24 h的IC50為47.6 μg/mL，低于作用于SMMC-7721細胞24 h時的IC50(3.75 μg/mL)，表明SFSP對HL-7702細胞毒性較小。

3 討論

肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，肝癌有惡性程度高、發展迅速、容易轉移、耐藥率高和治療困難等特點，其病死率僅次于肺癌和胃癌。肝癌早期治療主要以手術為主，但術后5年復發率較高，為70%～80%[6]；伴有轉移的中晚期肝癌僅能通過系統化療、局部介入等方法進行治療[7]。目前臨床上常用的化療藥物有順鉑、氟尿嘧啶和蒽環類抗癌抗生素等，但經過聯合化療的患者容易出現耐藥，療效不佳，5年生存率未見提高[8，9]。因此，為尋找療效好、毒性作用小的天然抗腫瘤活性組分對肝癌治療有積極意義。本課題組通過收集民間治療腫瘤的偏方，并對中草藥提取物和含藥血清進行體外抗癌活性篩選，首次發現裂果薯醇提物對肝癌、鼻咽癌細胞具有明顯的增殖抑制作用，進一步通過活性追蹤的方法發現其活性成分為皂苷[3，4]。本研究將不同濃度的SFSP作用于SMMC-7721細胞，發現SMMC-7721細胞增殖抑制率升高，劃痕愈合率降低，且呈劑量、時間依賴性，提示SFSP能夠抑制SMMC-7721細胞的增殖與遷移，但其具體機制有待進一步探索。

真核細胞主要經死亡受體介導的外源性凋亡途徑和內源性線粒體凋亡途徑介導發生凋亡。外源性凋亡途徑中，死亡受體通過與相關配體結合發生寡聚化及結構改變并激活銜接蛋白，引起下游Caspase激活而導致細胞凋亡[10]；在內源性線粒體凋亡途徑中，線粒體膜電位降低引起細胞色素C向胞質釋放，凋亡相關蛋白(Bax、Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL)平衡被打破，在Caspase蛋白的參與下，引起細胞凋亡[11，12]。本研究結果顯示，SFSP作用于SMMC-7721細胞后，細胞凋亡增多，且作用呈劑量依賴性，說明SFSP可誘導SMMC-7721細胞凋亡，機制可能涉及上述途徑。微管是細胞骨架的重要組成部分，由α和β兩種微管蛋白異二聚體聚合而成，與細胞形態維持、細胞運動、細胞物質運輸和分化、細胞有絲分裂及細胞信號轉導等功能密切相關，是抗腫瘤藥的重要靶點之一[13～17]。本研究發現，SFSP作用于SMMC-7721細胞后出現細胞周期阻滯及微管蛋白β高度聚集，微管蛋白異二聚體的聚合與解聚的動態平衡遭到破壞，進一步抑制細胞增殖并促使其凋亡。

上述結果顯示，SFSP體外作用于人肝癌SMMC-7721細胞后，具有明顯的增殖抑制、遷移抑制、誘導凋亡、細胞周期阻滯和促微管蛋白聚集的作用，初步表明了SFSP的抗腫瘤活性。然而，新藥的研究與開發必須包括安全性評價。我們將不同濃度的SFSP作用于人正常肝細胞HL-7702，測算細胞增殖抑制率，結果顯示，SFSP作用24 h時對HL-7702細胞的IC50為47.6 μg/mL，是其對SMMC-7721細胞IC50的10.87倍，提示SFSP對人正常肝細胞的毒性作用較小，可能具有良好的安全性。

綜上所述，SFSP可抑制SMMC-7721細胞增殖與遷移，誘導其凋亡，阻滯其細胞周期，且對正常肝細胞毒性作用較小，有望成為潛在的抗腫瘤藥，具有較大的新藥研究與開發價值。至于SFSP的具體抗腫瘤作用機制目前尚未明確，有待我們進一步研究。

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Effects of saponins from Schizocapsa plantaginea Hance on proliferation, migration and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells and its toxicity to normal hepatocytes

QIUHanchen1,SUNYuewen,LUOShunren,CHENYanyan,FULixiang,LIAOZhihong,HUANGXiuying,LIUBuming,TANGAnzhou,LIANGGang

(1CollegeofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of saponins from Schizocapsa plantaginea Hance (SFSP) on the proliferation, migration and apoptosis of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells and its toxicity to normal human hepatocytes HL-7702. Methods We chose the SMMC-7721 cells in the logarithmic phase and divided them into the administration group and the control group, cells in the administration group were treated with different concentrations of SFSP (0, 0.625, 1.25, 2.5 and 5 μg/mL) for 24 h. MTT assay was used to detect the proliferation inhibition rate of SMMC-7721 cells in order to finally calculate its half inhibitory concentration (IC50). SMMC-7721 cells in the logarithmic phase were treated with final concentrations of SFSP (0, 2, 4, and 6 μg/mL) for 24 h, and 48 h and then the scratch assay was used to observe the changes of cell migration ability. Furthermore, SMMC-7721 cells in the logarithmic phase were treated with final concentrations of SFSP (0, 2, 4, and 6 μg/mL) for 24 h, and meanwhile we observed their apoptosis and morphology by AO-EB double staining and immunofluorescence. We chose the HL-7702 cells in the logarithmic phase and separately treated them with different concentrations of SFSP (0, 2.5, 12.5, 25, 50 and 100 μg/mL) for 24 h. MTT assay was used to detect the proliferation inhibition rate of HL-7702 cells in order to finally calculate its IC50. Results After 0.625, 1.25, 2.5 and 5 μg/mL SFSP were applied to SMMC-7721 cells for 24, 48 and 72 h, the proliferation of cells was inhibited to different degrees. The inhibitory effect of SFSP on SMMC-7721 cells was in a time-and dose-dependent manner (allP<0.05). The IC50values of SFSP at 24, 48 and 72 h were 3.75, 1.56 and 0.95 μg/mL, respectively. After 0, 2, 4, 6 μg/mL SFSP were applied to SMMC-7721 cells, the healing rate of the cells was gradually decreased and the apoptotic cells were gradually increased (allP<0.05). SMMC-7721 cells shrank, appeared round or spindle shape, tubulin β fluorescence intensity decreased and highly aggregated, and a large number of cells in the split cycle. After 0, 2.5, 12.5, 25, 50 and 100 μg/mL SFSP were applied to HL-7702 cells for 24 h, the proliferation of cells was inhibited to different degrees. The IC50of SFSP was 47.6 μg/mL at 24 h, which was lower than that (3.75 μg/mL) of SMMC-7721 cells. Conclusions SFSP could significantly inhibit the proliferation and migration, induce the apoptosis, and block the cell cycle in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells. Meanwhile, SFSP have less toxic effect on normal human hepatocytes.

Schizocapsa plantaginea Hance; total saponins; hepatocellular carcinoma; cell proliferation; cell migration; apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81460620)；廣西自然科學基金資助項目(2014GXNSFDA118025)；廣西中藥質量標準研究重點實驗室(廣西壯族自治區中醫藥研究院)開放課題基金項目(桂中重開201105)。

邱漢琛(1990-)，男，在讀碩士，主要研究方向為抗腫瘤分子藥理學和天然藥物化學。E-mail: 471888837@qq.com

梁鋼(1957-)，男，博士生導師，教授，主要研究方向為天然藥物抗腫瘤分子藥理學及新藥研發。E-mail: lianggang22@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.001

R966

A

1002-266X(2017)15-0001-04

2016-11-13)