香延止痛方對寒凝血瘀證原發性痛經大鼠的治療效果及其作用機制

曹衛平，馬青，師偉，劉少玲，李霞，王東梅

(1 山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南250014；2 山東中醫藥大學附屬醫院；3 煙臺市中醫醫院；4 山東省醫學科學院基礎醫學研究所)

香延止痛方對寒凝血瘀證原發性痛經大鼠的治療效果及其作用機制

曹衛平1，2，馬青1，師偉2，劉少玲3，李霞4，王東梅2

(1 山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南250014；2 山東中醫藥大學附屬醫院；3 煙臺市中醫醫院；4 山東省醫學科學院基礎醫學研究所)

目的 探討香延止痛方對寒凝血瘀證原發性痛經大鼠的治療效果及其作用機制。方法 選擇大鼠50只，隨機分為空白組、模型組、西藥組及中藥低、高劑量組，模型組、西藥組及中藥低、高劑量組建立寒凝血瘀證原發性痛經模型，造模第7天，空白組和模型組予蒸餾水2 mL/只灌胃，西藥組予布洛芬按每日0.002 g灌胃2 mL/只，中藥低劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥2.38 g)，中藥高劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥11.9 g)。各組均連續灌胃6天。末次灌胃30 min，除空白組外，其余各組腹腔注射縮宮素，觀察大鼠扭體潛伏時間及30 min內扭體反應次數。采用ELISA法檢測各組子宮組織上清液INF-γ、IL-4水平，RT-PCR法檢測子宮組織上清液INF-γ、IL-4 mRNA表達。結果 中藥低、高劑量組30 min內扭體次數明顯少于模型組(P均<0.05)，扭體潛伏時間有延長趨勢(P均>0.05)。與空白組比較，模型組子宮組織上清液IFN-γ水平降低、IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4降低，TNF-α mRNA表達降低，IL-4 mRNA表達升高(P均<0.05)；與模型組比較，中藥低、高劑量組IFN-γ含量升高，IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4升高，TNF-α mRNA表達升高，IL-4 mRNA表達降低(P均<0.05)；但中藥低、高劑量組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。結論 寒凝血瘀型原發性痛經大鼠存在Th1/Th2平衡漂移，香延止痛方可能通過調節Th1/Th2的平衡狀態緩解痛經癥狀。

原發性痛經；寒凝血瘀證；香延止痛方；中藥；大鼠

原發性痛經臨床常見,長期嚴重的原發性痛經可導致經血逆流，明顯增加子宮內膜異位癥、子宮腺肌病的發生率，使不孕癥風險增加。據統計，大約10%的原發性痛經患者可發展為繼發性痛經，繼而引起子宮內膜異位癥[1]。原發性痛經以寒凝血瘀證最為常見[2]，本研究參照相關文獻[3，4]建立了寒凝血瘀證型原發性痛經大鼠模型，觀察香延止痛方的治療效果，并對其可能的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雌性Wistar大鼠50只，清潔級，2～3月齡，體質量180～200 g，由山東魯抗動物飼料經銷中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)20120002。所有大鼠于山東中醫藥大學附屬醫院實驗動物中心分籠飼養，每籠5只，室溫23～25 ℃，相對濕度50%～60%，通風及光照良好，標準鼠飼料常規喂養，自由攝食、飲水。香延止痛方，由醋香附、醋延胡索、肉桂、當歸、赤芍、白芍、鹽小茴香、干姜、陳皮、蒲黃、川芎、沒藥、肉豆蔻、甘草組成，由山東中醫藥大學附屬醫院中藥房提供；布洛芬緩釋膠囊(批號：H10900089，規格0.3 g/粒)，中美天津史克制藥有限公司；所有引物由上海博尚生物技術有限公司設計合成。大鼠血清IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒，美國R&D公司。

1.2 動物模型制備及處理 所有大鼠適應性飼養1周，按隨機數字表法將其分為空白組、模型組、西藥組及中藥低、高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組參照文獻[3，4]建立寒凝血瘀證原發性痛經大鼠模型：每天定時置于冰塊上20 min，連續12天，以寒冷刺激誘導形成寒凝血瘀證模型；同時，每天皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.4 mg/只，第1天及第12天為0.8 mg/只(首、末次加倍以保證其血藥濃度保持在一定水平)以使大鼠子宮同步化，并可提高大鼠子宮對催產素的敏感性，在第12天腹腔注射縮宮素2 U/只，使大鼠子宮產生強烈收縮，以制造寒凝血瘀證原發性痛經模型。寒凝血瘀證原發性痛經模型判定：大鼠出現寒戰，蜷縮少動，反應遲鈍，爪尾部紫暗，耳色暗紅，呼吸弱，喜扎堆，被毛無光澤，舌質紫暗，舌下脈絡增粗增長，并出現扭體反應。根據人與大鼠體表面積換算方法計算給藥劑量，造模第7天開始，空白組和模型組給予蒸餾水2 mL/只，西藥組給予布洛芬按每日0.002 g灌胃2 mL/只，中藥低劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥2.38 g)，中藥高劑量組給予香延止痛方水煎劑2 mL/只(含生藥11.9 g)。各組均連續灌胃6天。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 扭體潛伏時間及扭體次數 除空白組外，其余各組末次給藥30 min，腹腔內注射縮宮素2 U/只，記錄自注射縮宮素開始至出現扭體的潛伏時間及30 min內扭體次數。

1.3.2 子宮組織上清液IFN-γ、IL-4含量 各組大鼠麻醉后固定于手術板上，取出子宮，剪碎，200目銅網研磨過濾，1×PBS沖洗，400 g離心6 min，取上清。采用ELISA試劑盒說明加入稀釋好的標準品及待測樣品于反應孔內，溫育，洗滌；加入酶標試劑50 μL，溫育，洗滌；加入底物，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液，采用酶標儀測定各孔光密度(OD)值，利用CurveExpert1.3軟件計算子宮組織上清液IFN-γ、IL-4水平，并計算IFN-γ/IL-4。

1.3.3 子宮組織IFN-γ、IL-4 mRNA表達 采用RT-PCR法。取部分子宮組織，Ficoll密度梯度離心法分離子宮組織單個核細胞，制成細胞懸液。提取細胞總RNA，采用oligo dT為逆轉錄反應引物，取2.5 μg總RNA按RT試劑盒說明逆轉錄cDNA 20 μL。引物序列：TNF-α上游引物：5′-GCACCCCCAACCTATGAAGA-3′，下游引物：5′-CGGGAGCACTTGTCTACCTC-3′，擴增產物471 bp；IL-4上游引物：5′-CCTTGCTGTCACCCTGTTCT-3′，下游引物：5′-TCATTCACGGTTGCAGCTTCT-3′，擴增產物336 bp。總反應體系為25 μL，包含RT產物5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上下游引物各0.25 μL(25 pmol)，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DEPC水14 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃～60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共26個循環，最后70 ℃延伸10 min。1.5 %凝膠(EB染色)水平電泳，采用Alpha凝膠成像系統分析圖像。以β-actin為內參照，TNF-α、IL-4 mRNA條帶灰度值與同步β-actin條帶灰度值比值作為TNF-α、IL-4 mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 各組扭體潛伏時間及30 min內扭體次數比較 實驗過程中，空白組、中藥低劑量組和中藥高劑量組各死亡1只，模型組死亡2只。各組扭體潛伏時間及30 min內扭體次數比較見表1。

表1 各組扭體潛伏時間及30 min內扭體次數比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與西藥組比較，#P<0.05。

2.2 各組子宮組織上清液IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較 見表2。

表2 各組子宮組織上清液體IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與西藥組比較，#P<0.05。

2.3 各組子宮組織TNF-α、IL-4 mRNA表達比較 見表3。

表3 各組子宮組織TNF-α、IL-4 mRNA相對表達量比較

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

3 討論

原發性痛經屬中醫學“月經來腹痛”、“經行腹痛”“經痛”范疇，其病位在沖任、子宮，變化在氣血，病機為不通則痛或不榮則痛[5]，常見證型為氣滯血瘀、寒凝血瘀、濕熱瘀阻、氣血虛弱、肝腎虧損。有研究表明，寒邪是其主要病因，寒邪所致寒凝血瘀是最常見病機[6]。《素問·舉痛論》所言：寒氣入經而稽遲，泣而不行，客于脈外則血少，客于脈中則氣不通，故卒然而痛，即不通則痛。

Th1和Th2細胞均屬于輔助T細胞。未受抗原刺激的初始CD4+T細胞為Th，受到不同性質的抗原或細胞因子等因素的調控，可向不同譜系分化。在正常機體內，Th1細胞和Th2細胞通過分泌細胞因子參與不同的免疫反答，可互相調節或產生交叉調節作用，一般處于相對平衡的狀態。但當人體發生功能異常時，機體免疫系統選擇某一亞群為主的應答，這種Th細胞就會正反饋地增強自身優勢，壓制另一亞群的發展，即表現出Th1/Th2平衡偏向其中一方，即Th1/Th2平衡漂移現象。

目前已有研究報道，原發性痛經患者體內存在Th1/Th2平衡漂移現象。張茜薇等[7]研究認為，內分泌-免疫網絡失調是原發性痛經的發病原因之一，表現為Th2過度表達。而抑制Th2細胞因子過度表達，促使Th1/Th2趨于平衡可改善原發性痛經患者內分泌-免疫網絡失調的內環境達到治療目的。蔣競等[8]研究發現，雌二醇(E2)水平可影響體內Th1/Th2平衡，過高的E2引起Th1/Th2平衡向Th2漂移。E2及其受體表達水平升高，可引致相關致痛物質如PGF2α、TXB2、ET等含量過高，致使子宮肌痙攣、缺血進而產生疼痛[9]。此外，Th1和Th2亞群相關細胞因子亦與前列腺素的分泌密切相關[10]，其中TNF可刺激子宮內膜巨噬細胞產生PGE2，而IL-4可抑制PGE2的產生[11]。

香延止痛方是王東梅教授在長期臨床實踐中總結、提煉出來用于治療痛經的有效方劑，具有溫經散寒、化瘀止痛之效，臨床療效確切。前期動物實驗表明，香延止痛方可顯著延長痛經模型小鼠的扭體反應潛伏期，減少扭體反應次數，降低痛經模型大鼠子宮組織PGF2α含量，提高PGE2含量[12]。現代藥理學研究也證實，香延止痛方中組藥具有明顯的鎮痛作用。如陳運等[13]研究發現，香附揮發油0.1 g/kg灌胃能夠顯著減少醋酸引起的小鼠15、30 min內扭體次數，與0.03 g/kg阿司匹林效果相當；白芍總苷可顯著降低醋酸引起的小鼠扭體次數，亦具有較好的鎮痛效果[14]。

本研究顯示，模型組、西藥組及中藥低、高劑量組扭體潛伏時間比較差異無統計學意義，但較模型組有延長趨勢；而30 min扭體次數西藥組及中藥低、高劑量組較模型組明顯降低，且中藥低、高劑量組效果更好。說明香延止痛方可緩解寒凝血瘀證原發性痛經大鼠痛經癥狀。本研究還發現，模型組存在Th1/Th2失衡，平衡向Th2亞群漂移，即子宮組織IFN-γ降低、IL-4升高；西藥組及中藥低、高劑量組子宮組織IFN-γ均較模型組升高，IL-4含量均較模型組降低，以西藥組效果最好，而中藥低、高劑量組比較無統計學差異，說明香延止痛方能誘導Th1/Th2平衡向Th1亞群漂移。本研究還發現，西藥組及中藥低、高劑量組子宮組織上清液IFN-γ mRNA升高，IL-4 mRNA降低，與子宮組織IFN-γ、IL-4變化趨勢一致，說明香延止痛方可通過調節IFN-γ、IL-4 mRNA表達維持Th1/Th2亞群處于平衡狀態，進而改善痛經癥狀。 綜上所述，香延止痛方能明顯改善寒凝血瘀證原發性痛經大鼠的癥狀，其作用機制可能與調節Th1/Th2亞群的平衡狀態有關。但其具體機制和作用靶點還需在以后的課題中進一步深入研究。

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山東省重點研發計劃項目(2015GSF119010)。

王東梅(E-mail: 214693067@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.011

文獻標志碼：A 文章編號：1002-266X(2017)19-0040-03

2016-12-19)