原發性肝細胞癌組織中長鏈非編碼RNA MINCR、CDK2 mRNA的表達變化及其意義

王娟，付文廣

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000)

原發性肝細胞癌組織中長鏈非編碼RNA MINCR、CDK2 mRNA的表達變化及其意義

王娟，付文廣

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000)

目的 觀察原發性肝細胞癌(HCC)組織中長鏈非編碼RNA MINCR(LncRNA-MINCR)與周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)mRNA的表達變化，并探討其意義。方法 41例HCC患者，手術治療中均留取癌組織和癌旁組織，采用Real-time PCR法檢測癌、癌旁組織中lncRNA-MINCR和CDK2 mRNA，采用 Pearson相關性方法分析HCC組織中lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA相關性，并分析lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA的表達與原發性肝細胞癌患者臨床病理參數的關系。結果 HCC癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR的相對表達量分別為5.20±4.50、1.32±1.18，二者比較，P<0.001。HCC癌組織及癌旁組織CDK2的相對表達量分別為4.90±4.62、1.71±1.98，二者比較，P<0.001。相關性分析顯示，HCC患者癌組織lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA水平呈正相關(R2=0.260 1，P<0.001)。lncRNA-MINCR的表達與HCC患者腫瘤直徑、有無肝硬化有關(P均<0.05)，CDK2 mRNA的表達與HCC患者腫瘤直徑、AFP水平有關(P均<0.05)。結論 HCC癌組織中存在lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA高表達，二者在HCC的發生、發展中起協同作用。

肝腫瘤；肝細胞癌；長鏈非編碼RNA；lncRNA-MINCR；周期蛋白依賴性激酶2

原發性肝細胞癌(HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病機制目前仍不明確，臨床尚無有效治療方法，目前HCC患者五年生存率仍較低。研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在基因表達調控中具有重要作用[1,2]。MINCR是一個新近發現的lncRNA，既往研究發現轉錄因子MYC不僅可促進lncRNA-MINCR高表達，lncRNA-MINCR可反向調節轉錄因子MYC的功能，在癌癥的發生、發展中起協同驅動作用[3]。周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)是關鍵的細胞周期調節因子，其表達與包括肝癌在內的多種腫瘤的惡性增殖有關[4,5]。轉錄因子MYC可通過調節CDK/Rb/E2F通路影響CDK2的表達[6]。目前lncRNA-MINCR、CDK2 在HCC中的研究報道較少。本研究觀察了HCC癌組織中lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA的表達變化，分析其與HCC臨床病理參數的關系。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2015年12月間我院診治的41例HCC患者，其中男29例、女12例，年齡42～74歲，中位年齡56歲；術前均未行任何放化療或其他抗腫瘤治療，手術中均留取癌組織和距離腫瘤組織5 cm以外的癌旁正常組織，液氮保存備用，術后病理學均確認為HCC。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA檢測方法 采用Real-time PCR法檢測癌、癌旁組織中lncRNA-MINCR和CDK2 mRNA。應用TRIzol(Invitrogen)抽提組織總RNA，對所得的RNA進行逆轉錄。采用SYBR Green染料法，利用實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)檢測lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA的表達。每個樣本設置復孔3個。以GAPDH為內參。引物由Sangon Biotech合成。lncRNA-MINCR上游引物：5′-AGACTTGAATGGAGACATCAGC-3′，下游引物：5′-CCAGAGAAACAGAACCAATGA-3′；CDK2上游引物：5′-GTGGTACCGAGCTCCTGAAA-3′，下游引物：5′-AAAGATCCGGAAGAGCTGGT-3′；GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′；下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA的的相對表達量以2-ΔΔCt表示。ΔCt=Ct靶基因-CtGAPDH；ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。以lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA相對表達量的中位數及其以上水平判為高表達。

2 結果

2.1 癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA相對表達量比較 癌組織及癌旁組織lncRNA-MINCR的相對表達量分別為5.20±4.50、1.32±1.18，二者比較，P<0.001。癌組織及癌旁組織CDK2 mRNA的相對表達量分別為4.90±4.62、1.71±1.98，二者比較，P<0.001。

2.2 HCC組織lncRNA-MINCR表達與CDK2 mRNA表達的相關性 相關性分析顯示，HCC患者癌組織lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA水平呈正相關(R2=0.260 1，P<0.001)。

2.3 lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA表達與HCC患者臨床病理參數的關系 lncRNA-MINCR的表達與HCC患者腫瘤直徑、有無肝硬化有關(P均<0.05)，CDK2 mRNA的表達與HCC患者腫瘤直徑、AFP水平有關(P均<0.05)。見表1。

表1 lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA表達與HCC患者臨床病理參數的關系(例)

3 討論

HCC是一種高病死率的惡性腫瘤，每年超過100萬患者死亡[7]。肝癌發生、進展與轉移的機制十分復雜，目前臨床尚未發現可靠治療靶點。研究[8]發現，單純DNA改變并不能解釋HCC的復雜進程。對基因在不同水平參與表達調控的機制進行深入而廣泛的探討是目前HCC診斷和治療的研究熱點。

myc基因是較早發現的一組癌基因，與之同源的病毒癌基因存在于MC29及其它一些具有高度致癌性的猿逆轉錄病毒中。myc基因高水平表達時可轉化嚙齒類成纖維細胞。MYC家族是一類具有轉錄因子效應的核蛋白類調控基因，其可以通過靶向調節Bcl-2、CDK4、CDC25A、CCND1等蛋白，在細胞增殖、分化與凋亡等方面發揮重要的調控作用[8]。MYC作為原癌基因，在多數腫瘤中異常擴增，驅動腫瘤惡性轉化，并導致患者預后不良。但目前關于調節MYC表達與功能的分子機制還尚不清楚。lncRNA是一類長度大于200 nt不具有蛋白編碼能力的轉錄本。近年，lncRNA參與基因表達調控的作用越來越受到人們的重視，但絕大多數的lncRNA的功能仍然知之甚少[1]。Doose等[3]發現MYC過表達的細胞系與MYC基因變異擴增的B淋巴細胞瘤患者中，一個長鏈非編碼RNA異常高表達，具有原癌基因的功能，且與MYC的表達存在正相關性，并命名為MINCR。同樣，Wang等[9]發現lncRNA-MINCR在膽囊癌中異常過表達，并促進了膽囊癌的進展，導致更差的總體的幸存。本研究發現，HCC癌組織中存在lncRNA-MINCR高表達，與HCC患者臨床病理參數的關系顯示，lncRNA-MINCR的表達與HCC患者腫瘤直徑、有無肝硬化有關。腫瘤直徑增大與癌細胞的增殖能力增強有關，另外，肝硬化的發生與廣泛肝細胞、結締組織過度再生與重建關系密切。因此可猜測，lncRNA-MINCR在HCCF癌組織的異常表達將導致細胞惡性增殖，但lncRNA-MINCR調節HCC癌細胞增殖的具體機制還需要深入探討。

CDK2是細胞周期依賴性蛋白家族成員，其主要是通過與周期蛋白結合形成活化狀態的蛋白激酶復合物，催化RB磷酸化，驅動周期進程并促進細胞分裂[10]。大量研究發現CDK2在肺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、乳腺癌與惡性膠質瘤等腫瘤過度表達與活化[11，12]。本研究發現，HCC癌組織中CDK2 mRNA異常高表達；與HCC患者臨床病理參數的關系顯示，CDK2 mRNA的表達與HCC其表達量與血清AFP水平、腫瘤直徑有關。Mizejewski等[13]研究表明，AFP與一些細胞周期依賴性蛋白存在相互作用并參與調控細胞周期。肝細胞癌組織中存在CDK2異常過表達，并可促進癌細胞的增殖能力增強[14]。

本研究還發現， HCC患者癌組織lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA水平呈正相關，這提示lncRNA-MINCR與CDK2 mRNA間可能存在正性調控機制，過表達的lncRNA-MINCR可能促進CDK2 mRNA的表達，從而促進HCC癌細胞的惡性增殖。早在1999年，Mateyak等[17]就發現MYC的缺失將抑制Cyclin E-CDK2復合物形成，阻滯細胞周期進程。但MYC是通過何種機制調節Cyclin E-CDK2復合物的形成尚不清楚。lncRNA-MINCR是MYC誘導表達的一個長鏈非編碼RNA分子，作為MYC的下游分子，MYC可能通過lncRNA-MINCR途徑直接參與調節CDK2的表達。Doose等[3]發現，干涉lncRNA-MINCR表達之后，MYC作為轉錄因子結合于CDK2啟動子區域的能力大大減弱，從而引起CDK2表達的降低。但目前研究仍沒有揭示lncRNA-MINCR是通過何種作用影響MYC的功能。lncRNA-MINCR在肝細胞癌中調控CDK2表達進而促進細胞增殖的機制仍需進一步探究。

綜上所述，HCC癌組織中存在lncRNA-MINCR、CDK2 mRNA高表達，二者在HCC的發生、發展中起協同作用。

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