干旱脅迫下馬尾松幼苗針葉揮發性物質與內源激素的變化*

全文選 丁貴杰

(1. 貴州大學林學院 貴陽 550025; 2. 貴州省森林資源與環境研究中心 貴陽 550025; 3. 貴州師范大學山地環境重點實驗室 貴陽 550001)

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干旱脅迫下馬尾松幼苗針葉揮發性物質與內源激素的變化*

全文選1,3丁貴杰1,2

(1. 貴州大學林學院 貴陽 550025; 2. 貴州省森林資源與環境研究中心 貴陽 550025; 3. 貴州師范大學山地環境重點實驗室 貴陽 550001)

【目的】 探討干旱脅迫下馬尾松幼苗針葉內源激素含量變化與揮發性物質釋放規律，為馬尾松抗逆生理研究和育苗提供科學依據?！痉椒ā?采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結合氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)，對不同干旱脅迫處理的馬尾松幼苗針葉揮發性物質進行鑒定，并采用高效液相色譜串聯三重四級桿質譜法(LC-MS/MS)測定其內源激素含量。【結果】 GC-MS鑒定出13種揮發性物質，屬于萜類、醛類、醇類和酯類化合物，其中9個化合物確定為萜類，相對含量較高的物質是α-蒎烯、石竹烯和α-水芹烯。干旱脅迫時馬尾松幼苗針葉單萜類相對含量先降低后逐漸升高，倍半萜類相對含量則先升高再逐漸降低，干旱脅迫明顯誘導針葉單萜類含量增加； 馬尾松幼苗針葉脫落酸(ABA)和玉米素(ZT)含量隨著干旱脅迫程度加大呈明顯增加趨勢，赤霉素(GA)和生長素(IAA)含量隨著干旱脅迫程度加大呈逐漸降低趨勢。【結論】 HS-SPME可作為干旱脅迫下馬尾松幼苗針葉揮發性物質提取的有效手段，GC-MS適合于馬尾松幼苗針葉揮發性物質的識別； 干旱脅迫時馬尾松幼苗針葉含有豐富的單萜和倍半萜，針葉通過調節單萜與倍半萜比例響應干旱脅迫； 干旱脅迫時馬尾松幼苗針葉通過內源激素相互協調來適應干旱逆境，其中ZT和ABA是其重要的干旱脅迫信號激素。

馬尾松； 干旱脅迫； 揮發性物質； 內源激素

馬尾松(Pinusmassoniana)以速生、豐產、適應性強、綜合利用程度高、用途廣等優良特性成為我國最重要的鄉土用材樹種，廣泛分布于秦嶺、淮河以南，云貴高原以東的17個省區市(丁貴杰等, 2006)。干旱災害嚴重影響馬尾松的生長和繁殖，但馬尾松強大的根系吸水能力增強了對逆境的適應性，從而使其成為了植樹造林的主要先鋒樹種之一。以往對馬尾松脅迫生態學研究主要集中在生物和非生物脅迫方面(Wangetal., 2013; Huetal., 2014; Fanetal., 2016)，而提高樹種的抗旱性是森林培育的主要目標之一，因此強化研究馬尾松對干旱環境的適應機制至關重要。

近年來，植物信號研究成為國內外研究熱點，受到廣泛關注。當植物遭受環境脅迫時，針葉可以釋放揮發性物質，這些物質具有直接和間接的信號調控作用(Laothawornkitkuletal., 2008)。植物釋放揮發性物質是其重要的防御性反應，揮發性物質包括萜烯類和脂肪酸衍生物等，是植物抵抗逆境條件的重要信號(Dixon, 2001; Loretoetal., 2010)。植物內源激素參與其適應脅迫的全過程，包括激素的合成、運輸和信號控制(Santneretal., 2009; Rossetal., 2011)，不同內源激素在脅迫條件下作用不同(Pelegetal., 2011)。

植物葉片的抗逆性有助于提高整株植物的抵抗力(Sacketal., 2006)，因此深入分析不同干旱條件下馬尾松針葉的次生代謝變化十分必要。本研究的科學意義： 針葉揮發性物質和內源激素作為馬尾松感受環境脅迫的一種信號，是否可以作為定量指標來評價其對干旱脅迫的響應狀況？通過研究馬尾松幼苗對不同干旱脅迫的調節能力，從次生代謝物的變化方面深入探討馬尾松對干旱脅迫的適應與抗逆機制，是對該造林樹種抗逆性的進一步研究和認識，并為速生豐產林的培育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

2016年3月，在貴州省麻江縣苗圃選取長勢一致的馬尾松1年生實生苗作為試驗材料。干旱脅迫試驗在貴州師范大學溫室進行，盆栽緩苗后于6月15日在溫室內對幼苗進行干旱處理。采用盆栽稱質量控水法，設計4個水分梯度， 即最大田間持水量的75%～80%(對照，CK)、55%～60%(輕度干旱，LD)、40%～45%(中度干旱，MD)和30%～35%(重度干旱，SD)。每處理20盆，每盆1株。統一澆水管理，每天18:00通過稱質量法維持土壤相對含水量在試驗設計的范圍內，60天后進行指標測定。

1.2 指標測定

1.2.1 揮發性物質測定條件 GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀由日本島津生產，SPME 和 100 μm PDMS萃取頭由美國 Supelco 公司制造。每個水分梯度處理選取10株幼苗的莖段中部針葉鮮樣剪碎混合后，取50 mg于10 mL頂空瓶中，放適量無水硫酸鈉，插入老化后的萃取頭，密閉，75 ℃恒溫浴鍋內萃取10 min后，進行GC-MS分析。

GC 條件： 色譜柱為VF-WAXms (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)； 載氣為氦氣 (99.999%)；柱前壓49.5 Pa；柱流量1 mL· min-1； 取樣時間1 min。進樣口溫度230 ℃；程序升溫，40 ℃保持5 min，以 5 ℃·min-1的速度升至 250 ℃保持 5 min。MS 條件： 電子轟擊源為EI； 電子能量70 eV； 離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑切除時間3 min；掃描質量范圍40～450；掃描間隔0.5 s。

1.2.2 內源激素測定條件 Agilent 1290 液相色譜儀、Agilent 6460C 三重四極桿質譜儀和配電噴霧離子源為美國安捷倫公司生產，4種內源激素ZT、IAA、ABA和GA 標準品為色譜純級，Sigma公司生產。色譜條件和質譜條件參照文獻(Kojimaetal., 2009; Diegoetal., 2012)，并在取樣量和內源激素提取方法上加以改進。取針葉樣品2 g，于液氮中研磨成粉末，分離上清液，過聚乙烯聚吡咯烷酮PVPP柱和二乙基氨基乙基交聯葡聚糖凝膠(DEAE Sephadex A-25)柱凈化，過0.22 μm 濾膜后檢測。

1.3 數據處理

根據總離子流峰面積歸一化法計算各組分相對含量。揮發性物質鑒定基于NTST147及NTST127標準圖譜庫(Hewlett Packard, Palo Alto, California, USA)進行相似度檢索 (匹配度大于90%) 和相關文獻報道，確定揮發性物質的化學結構(Kimetal., 2013; Ioannouetal., 2014)。采用Origin 6.1(軟件)繪圖，SPSS18.0軟件進行數理統計分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對苗木生長形態的影響

生物量、根冠比是評價植物耐干旱能力的重要指標，通常干旱脅迫顯著抑制幼苗生物量增加。輕度、中度和重度脅迫時，馬尾松苗木生物量均較對照顯著降低；不同干旱處理苗高增長量與對照均差異顯著；輕度、中度脅迫時苗木根冠比與對照差異顯著，重度脅迫不顯著(表1)。

表1 干旱脅迫下馬尾松幼苗生長①Tab.1 The growth of masson pine seedlings under drought stress

① 不同小寫字母表示在P<0.05水平同列不同處理的顯著差異。Different lowercase letters indicate significant differences at theP<0.05 level between treatments or control.

2.2 干旱脅迫下揮發物成分及其變化

不同水分梯度幼苗針葉揮發性物質GC-MS總離子流色譜圖見圖1。通過對總離子流色譜圖中各組分圖譜分析及資料核實，從對照、輕度、中度、重度脅迫均鑒定出13種揮發物，峰號依次為順-3-己烯醛(1)、α-蒎烯(2)、反-2-己烯醛(3)、反-3-己烯醇(4)、β-蒎烯(5)、月桂烯(6)、D-檸檬烯(7)、α-水芹烯(8)、4-蒈烯(9)、醋酸冰片酯(10)、石竹烯(11)、α-石竹烯(12)、大根香葉烯D(13)，其中單萜類6種、倍半萜類3種，其他類4種。

由表2可知，在鑒定出的揮發性物質中，相對含量較高的有α-蒎烯、α-水芹烯、石竹烯、大根香葉烯D、反-3-己烯醇等，這些揮發物構成馬尾松針葉的主要揮發性成分。對照針葉揮發性成分中，單萜類相對含量最高，占59.97%，其中以α-蒎烯(31.54%)和α-水芹烯(14.35%)為主； 倍半萜類占30.47%，主要是石竹烯(23.06%)。輕度脅迫時針葉揮發性成分中，單萜類相對含量最高，占48.64%，主要包括α-蒎烯(20.16%)、α-水芹烯(11.89%)等； 倍半萜類占32.26%，主要是石竹烯(21.78%)。中度脅迫時針葉揮發性成分中，也是單萜類相對含量最高，占51.77%，主要包括α-蒎烯(27.87%)、α-水芹烯(13.04%)等； 倍半萜類占30.96%，主要有石竹烯(21.78%)、大根香葉烯 D(11.46%)。重度脅迫時針葉揮發性成分中，單萜類相對含量達到61.69%，主要包括α-蒎烯(32.32%)、α-水芹烯(17.55%)等； 倍半萜類占20.69%，主要是石竹烯(15.67%)。

α-蒎烯、α-水芹烯的相對含量隨干旱脅迫程度加大呈“高-低-高”變化趨勢，在重度脅迫時最高； 石竹烯的相對含量隨干旱脅迫程度加大呈不斷下降趨勢； 大根香葉烯D和反-3-己烯醇隨干旱脅迫程度加大呈“低-高-低”變化趨勢，均在中度脅迫時最高。

2.3 干旱脅迫下針葉內源激素的動態變化

內源激素通過植物與所處外部環境的相互作用調節來適應環境脅迫，如控制植物株型、水分和營養的利用等。對馬尾松幼苗針葉4種內源激素的差異性分析可知，赤霉素和生長素含量均隨干旱脅迫程度加大呈逐漸降低趨勢，重度脅迫時含量最低(其中赤霉素比對照下降約50%)； 玉米素、脫落酸含量隨干旱脅迫程度加大均呈逐漸升高趨勢，重度脅迫時含量最高，分別比對照提高約5.5和4倍(圖2)。

3 討論

3.1 干旱對馬尾松幼苗生長和針葉揮發性物質的影響

干旱是制約林業可持續發展的重要因素，影響樹木生長(Vacchianoetal., 2012)，改變有機物成分等(Pichleretal., 2007)。本研究表明，重度干旱脅迫顯著抑制馬尾松苗高和生物量的增長，而輕度、中度干旱脅迫則促進根冠比的增大。

揮發性物質在針葉樹防御昆蟲和病原體中發揮著重要作用(Bracho-Nunezetal., 2011)，其中萜類常作為植物化學標記物在松屬植物防御中發揮關鍵作用(Achotegui-Castellsetal., 2013)。揮發性萜類對干旱脅迫的響應度高，對植物抵抗逆境脅迫具有重要意義(Gargallo-Garrigaetal., 2014)。本研究表明，馬尾松具有較高的調節能力，并可分配針葉內不同的次生代謝產物，該結果對于馬尾松逆境生態學研究具有重要意義。馬尾松針葉揮發性物質中α-蒎烯含量最高，其次是大根香葉烯D、β-蒎烯和石竹烯(Ioannouetal., 2014)，本研究的揮發性物質組成與以往研究結果相近。本研究中單萜類和倍半萜類是各個干旱脅迫處理的主要揮發性物質，且2類物質比例在不同脅迫處理下呈動態變化，其中單萜類含量隨著干旱脅迫程度加大而上升，與前人研究結果較為一致(Simpragaetal., 2011)。本研究結果顯示，不同干旱脅迫下馬尾松揮發性物質數量不變，干旱脅迫僅改變了不同組分的相對含量，這說明揮發性物質的生物合成主要受遺傳控制，環境因素影響其含量變化。

圖1 干旱脅迫下馬尾松針葉揮發性物質的總離子流色譜Fig.1 Total ion current of volatiles of masson pine needles under drought stresses

表2 干旱脅迫下揮發性物質及其相對含量變化Tab.2 Main volatiles and their relative content at different levels of drought stress in needles of Masson pine seedlings

圖2 干旱脅迫下馬尾松針葉內源激素變化Fig.2 Endogenous hormone at levels of drought stress in needles of masson pine seedling不同小寫字母顯示在P<0.05水平同一激素不同處理間差異顯著。Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level between treatments of the same endogenous hormone.

圖3 馬尾松針葉內揮發性物質的分子結構Fig.3 Molecular structures of plant volatiles in needles of masson pine seedling

3.2 針葉揮發性物質的主要代謝途徑

馬尾松針葉揮發性物質的生物合成主要通過4種生化途徑(圖3)： 脂肪氧合酶途徑(GLV-s)合成的綠葉揮發物(Hatanaka, 1993)、莽草酸途徑合成的芳香揮發物(Pareetal., 1996)、赤霉素途徑(MEP)合成的單萜類化合物(Picherskyetal., 2006; Rajabi Memarietal., 2013)和甲羥戊酸途徑(MVA)合成的倍半萜類化合物(Rajabi Memarietal., 2013; Rosenkranzetal., 2013)。任何生物或非生物脅迫都可能改變植物揮發性物質的釋放速率，改變其比例(Holopainenetal., 2010; Niinemetsetal., 2013)，如葉片損傷增加植物倍半萜類的釋放(Theisetal., 2009)，本研究與以往研究結果一致。萜類物質具有獨特的化感活性，往往在較低濃度即能表現出很強的抑制作用，萜類物質在植物的相互作用中起著重要作用，如自毒作用、植物防御和環境脅迫等(Yangetal., 2008; Chenetal., 2011; Singhetal., 2015)。

3.3 馬尾松針葉內源激素對干旱脅迫的響應

生長素對干旱脅迫響應主要是針對吲哚乙酸(IAA)的研究。IAA是公認的根源信號物質，參與多種植物生長過程(Shietal., 2014)，但針對干旱脅迫下植物生長素含量的變化研究相對較少。有研究認為干旱初期植物葉片的瞬時IAA含量增加，但隨著干旱脅迫的持續其含量大幅下降(Wangetal., 2008)。本研究各干旱脅迫處理的馬尾松針葉IAA含量是在較長時間脅迫后測定，隨著干旱程度的加大其含量逐漸下降。

赤霉素(GA)在植物葉的分化、光形態建成等過程中扮演重要角色。本研究結果顯示，馬尾松針葉赤霉素含量隨著干旱脅迫程度加大呈逐漸降低趨勢，重度脅迫時含量最低。GA含量降低是馬尾松應對干旱條件的生態策略，其含量降低可誘導芽休眠以應對干旱(Zawaskietal., 2014)。

脫落酸(ABA)被稱為脅迫激素，逆境條件下植物內源激素ABA 變化是研究植物抗逆的熱點。ABA在根和葉中都能合成(Thompsonetal., 2007)，有研究認為干旱脅迫下植物根合成ABA并轉移到葉，導致氣孔關閉，抑制植物生長，從而使植物適應干旱脅迫(Parketal., 2015)。本研究結果顯示，隨著干旱脅迫加大針葉ABA含量呈逐漸升高趨勢。

玉米素(ZT)是植物體內主要的細胞分裂素之一，其含量變化是植物對環境脅迫的響應(Haetal., 2012)。前人研究認為干旱脅迫下植物葉片ZT含量升高(Diegoetal., 2012; Liuetal., 2016)。本研究結果顯示，針葉ZT隨著干旱脅迫程度加大含量逐漸升高且變化幅度最大，馬尾松針葉內源ZT是最具代表性的干旱脅迫信號激素，其變化機制有待進一步研究。

4 結論

1) 頂空固相微萃取(HS-SPME)方法，需要樣品量少，對苗木傷害小，檢測快速方便，靈敏度高，成本低，可以作為揮發性物質的提取方法。本研究建立的方法，可以快速測定9個主要馬尾松揮發性萜類成分，GC-MS是適合于鑒定馬尾松針葉揮發性物質的一種手段。

2) 干旱脅迫時馬尾松幼苗針葉揮發性物質種類穩定，每個針葉樣品均含有豐富的單萜類和倍半萜類物質。針葉通過轉化單萜類與倍半萜類含量的比例來響應干旱脅迫，α-蒎烯和α-水芹烯是單萜類含量的主要成分，倍半萜類主要由石竹烯和大根香葉烯D組成。

3) 干旱脅迫時馬尾松幼苗針葉中ZT與ABA含量迅速升高，可作為重要的干旱脅迫信號，誘導植物體一系列生理生化變化以應對干旱脅迫。同時，內源IAA和GA含量降低，與其他逆境響應因子協調馬尾松生理反應，避免干旱傷害。

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(責任編輯 王艷娜 郭廣榮)

Dynamic of Volatiles and Endogenous Hormones inPinusmassonianaNeedles under Drought Stress

Quan Wenxuan1, 3Ding Guijie1, 2

(1.CollegeofForestry,GuizhouUniversityGuiyang550025; 2.ResearchCenterforForestResources&Environment,GuizhouProvinceGuiyang550025; 3.KeyLaboratoryofMountainousEnvironmentalProtection,GuizhouNormalUniversityGuiyang550001)

【Objective】 This study aimed to reveal the change pattern of endogenous hormones content and volatile compounds in Masson pine seedlings under drought stress, and to provide a foundation for studying the stress-resistance physiology and nursery of Masson pine. 【Method】 The seedling volatiles, under different drought stress, were identified by headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME) combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and the endogenous hormones were analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). 【Result】 A total of 13 types of volatiles were identified with GC-MS, they belong to terpenoids, aldehydes, alcohols, and ester compounds. Nine types were identified as terpenoids, and among them, α-pinene, caryophyllene, and α-phellandrene had relatively higher content. Under drought stress, relative content of monoterpenes decreased first and then increased as the drought stress intensified, but relative content of sesquiterpenes increased first and then decreased. Drought conditions promoted the synthesis of monoterpenes. The content of ABA and ZT in needles was gradually increased with the strengthening of drought stress, but GA and IAA content was decreased gradually with the strengthening of drought stress. 【Conclusion】 HS-SPME could be one of the effective techniques to extract the volatiles of Masson pine under drought stress condition, and GC-MS is suitable for the needle volatiles identification. Under drought stress, Masson pine needles are rich in monoterpenes and sesquiterpenes. Through altering the ratio of monoterpenes and sesquiterpenes, seedlings enhanced the drought resistance. Endogenous hormones improved the drought-resistant ability to adapt the drought stress through coordination with each other. ZT and ABA are important hormones of drought stress, and deserve further study.

Pinusmassoniana; drought stress; volatiles; endogenous hormones

10.11707/j.1001-7488.20170406

2016-10-26；

2017-02-15。

國家自然科學基金項目(31260183； 31660200); 國家科技支撐課題(2015BAD09B01); 貴州省重大專項課題(黔科合重大專項字[2012]6001號); 貴州省高層次創新人才課題(黔科合人才[2015]4003號)。

S718.43

A

1001-7488(2017)04-0049-07

*丁貴杰為通訊作者。