毛果楊Rubisco活化酶基因的克隆與功能分析*

尹 吳 孫偉博 周 燕 諸葛強

(南京林業大學 南方現代林業協同創新中心 林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室 南京 210037)

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毛果楊Rubisco活化酶基因的克隆與功能分析*

尹 吳 孫偉博 周 燕 諸葛強

(南京林業大學 南方現代林業協同創新中心 林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室 南京 210037)

【目的】 核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是參與植物光合作用的第1步碳同化的關鍵酶，而Rubisco活化酶(RCA)能夠使Rubisco處于穩定的催化活性狀態，從而提高光合效率。本研究從毛果楊中克隆RCA基因并通過遺傳轉化南林895楊，獲得PtRCA高表達的轉基因株系，并進行分子檢測及相關功能分析，為培育楊樹新型高光效抗逆品種提供依據。【方法】 基于毛果楊基因組數據庫信息克隆PtRCA基因序列，利用生物信息學對PtRCA基因進行功能和結構分析。采用Gateway技術將PtRCA構建到植物表達載體pGWB406中，以南林895楊為受體材料，通過農桿菌介導法進行遺傳轉化。以轉PtRCA基因南林895楊和對照(南林895楊)為材料，測定分析在高溫脅迫下轉基因植株的基因表達、光合參數和葉綠素熒光參數的差異。【結果】 從毛果楊中克隆獲得PtRCA的CDS序列長1 323 bp，編碼440個氨基酸殘基，其蛋白相對分子質量為48 315.9 Da，等電點pI為5.57，為疏水性蛋白，無信號肽以及跨膜結構； 通過序列對比，發現PtRCA屬AAA+超級家族一員，且與大豆、擬南芥RCA蛋白同源性較高。轉PtRCA基因南林895楊RCA表達量均高于對照，且能夠利用強光充分進行光合作用，其光飽和點也均高于對照，增加約12.5%～37.5%； 光補償點除3號株系外，其他轉基因株系均略低于對照； 轉基因植株在光飽和點的光合速率比對照增高24.6%～55.7%。轉基因株系對CO2的利用能力和羧化效率均強于對照組，CO2飽和點除1號和4號株系外，其他株系均比對照低12.5%～25.0%； CO2補償點比對照降低53.1%～80.4%； 光呼吸比對照低37.7%～79.3%，并且轉基因楊樹在CO2飽和點的光合速率比對照增高4.4%～26.4%。另外，轉基因楊樹表現出耐光氧化的能力，光氧化處理后，對照PSⅡ原初光化學效率下降61.7%，而轉基因楊樹下降45.0%～53.1%； 對照PSⅡ實際光化學效率下降54.1%，而轉基因楊樹下降38.7%～52.0%； 光化學猝滅系數對照下降68.3%，而轉基因楊樹下降51.0%～65.8%； 非光化學猝滅系數對照僅增加3.0%，而轉基因楊樹增加6.0%～26.5%。【結論】 楊樹Rubisco活化酶(PtRCA)蛋白與大豆、擬南芥RCA蛋白同源性較高。通過實時定量及相關生理分析表明，轉PtRCA基因南林895楊具耐高溫特性，利用CO2和強光進行光合作用的能力較強，催化RuBP進行羧化反應的效率較高。轉PtRCA基因楊樹能夠充分利用吸收的光子，PSⅡ反應中心效率較高，過剩光能量得到較好的耗散，表現出耐光氧化的能力。研究結果表明，PtRCA基因的高效表達提高了轉基因植株的光合效率，并對高溫高光強具有調節能力。

楊樹； Rubisco活化酶基因； 轉基因； 光合作用

光合作用是植物學中最活躍的研究領域，也是地球上最重要的化學反應之一。Calvin循環是高等植物進行光合作用碳固定的最基本途徑，其反應共有13步，由RuBP(核酮糖-1，5-二磷酸)開始到RuBP再生結束，所有反應均在葉綠體基質中進行(Rainesetal., 2006; Smithetal., 2007)。Calvin循環的第1步反應由核酮糖-1，5二磷酸羧化酶(EC 4.1.1.39, 簡稱Rubisco)催化。Rubisco是光合碳固定的關鍵酶，其催化RuBP羧化反應和加氧反應，并進一步調節2種反應的關系(Jurczyketal., 2015)。在植物體內環境中，Rubisco的活性受Rubisco活化酶(Rubisco activase, RCA)的調節與控制，即Rubisco必須經過RCA的活化，才能表現出其羧化與加氧活性(Parryetal., 2012)。因此，RCA的發現為提高植物Rubisco活力，從而提高碳固定的效率提供了新的思路。因此，RCA的生理與分子生物學研究已經成為光合作用領域的熱門課題(李海霞等， 2010)。

隨著基因工程的發展，克隆、表達、轉化RCA基因等相關研究工作已經逐步展開。科學家們成功克隆擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大麥(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、棉花(Gossypiumspp.)等植物RCA基因的cDNA(Wernekeetal., 1989; Rundleetal., 1991; Toetal., 1999; Salvuccietal., 2003)。研究發現，RCA基因對短期高溫脅迫反應較為敏感，但其表達存在轉錄后調控，這種機制對于提高植物光合作用，從而應對長期高溫脅迫具有重要意義(DeRidderetal., 2007)。光照強度對RCA活性影響的相關研究表明： RCA活性會隨著光量子通量密度的增加而隨之增加，而光強達到300 μmol·m-2s-1時迅速趨于飽和狀態； 然而Rubisco活性要在1 000 μmol·m-2s-1光照強度時才趨于飽和(姜振升等， 2010)。對水稻進行高溫脅迫的試驗表明，RCA對植物抗高溫有調節作用，主要由于面臨高溫脅迫時，植物體內的RCA能夠與熱激蛋白等分子伴侶蛋白互作，從而保證高溫處理下RCA的活性(Yamorietal., 2012)。轉RCA基因植株在熱脅迫時仍具有較高的光合速率(Bayramovetal., 2014)。另有報道，RCA也是一種能夠與赤霉素相結合的磷蛋白，對GA信號的傳遞有積極作用(Stotzetal., 2011)。RCA與植物光合作用速率(Tsaietal., 2015)和植物產量(Yinetal., 2014)具有密切關系。這些研究為使用基因工程技術改良作物及經濟林木，提高其光合速率和抗逆性提供了新的思路。

楊樹(Populus)是一種適應能力強、品種繁多、生長速度快的優良樹種，可作為人造板、造紙原料等，基因工程技術對提高楊樹抗逆性提供了新途徑。本研究選擇楊樹為研究材料，利用楊樹基因組序列信息，克隆毛果楊(Populustrichocarpa)PtRCA基因，通過農桿菌(Agrobacterium)介導遺傳轉化南林895楊(P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin895’)，獲得PtRCA高效表達植株，并進行分子檢測及相關功能分析，為培育楊樹新型高光效抗逆品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

毛果楊及南林895楊無菌組培苗均于溫度22 ℃、光強4 000 lx、日光照16 h的溫室內培養，分別用于目的基因克隆以及相關功能分析。

1.2 毛果楊PtRCA基因的克隆及分析

采用BIOMIGA公司的EZgeneTM Plant Easy Spin RNA Miniprep Kit (R6611)試劑盒提取毛果楊總RNA； 使用TAKARA公司提供的試劑反轉錄cDNA。根據已有的PtRCA基因序列的保守區，設計5′端及3′端特異引物(表1)，擴增PtRCA基因的編碼區，并進行D-TOPO PCR反應。將所得PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，連接到PMD 19載體上，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP 10，經過藍白斑篩選得到陽性克隆，挑選單克隆，交金斯瑞公司測序，并進行相關序列比對，利用生物信息學軟件對PtRCA基因進行基因功能及其結構分析(表2)。

表1 克隆擴增引物及RT-PCR表達分析引物Tab. 1 Primers used in full length cloning and RT-PCR analysis

表2 基因序列分析軟件以及相關網址Tab. 2 Gene sequence analysis softwares and related web sites

1.3 溫度脅迫下RCA基因表達模式分析

用于溫度脅迫試驗的植物材料為南林895楊溫室生長苗(22 ℃)，6周正常生長后進行脅迫處理。第1種處理： 脅迫溫度梯度設置為10， 20，30 ℃，分別在脅迫1，3，5，7，9天后取葉片，進行相關定量分析； 第2種處理： 37 ℃高溫條件下，分別在0，2，4，8，12 h時取葉片； 再將溫度調回室溫22 ℃，分別在2，4，8，12 h時取葉片，對所有葉片樣本進行相關定量分析。每次試驗相互獨立，分別重復3次。

1.4 楊樹PtRCA基因表達載體構建

PMD 19 T質粒； 用于入門載體擴增的TOP 10大腸桿菌菌株； 用于表達載體擴增的DB 3.1大腸桿菌菌株； 表達載體pGWB 406(日本RIKEN理化研究所贈予)。

按照Gateway反應程序，設計BP反應引物，F端： GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAAGGCTCC ATGGCAGCCACCATCTCCAC； R端： GGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAACCATAGAAAGTT CCTC。PCR 產物回收純化后進行BP 反應和LR 反應。將LR反應產物轉化到TOP 10感受態細胞，進行菌落PCR驗證并測序，提取質粒，得到目的基因植物表達載體，-20 ℃保存。

1.5 楊樹PtRCA基因的遺傳轉化與分子檢測

將含有sGFP基因的表達載體轉入農桿菌EHA 105，通過葉盤法進行遺傳轉化。侵染濃度OD600值設置為0.6，預培養時間3天，重懸時間60 min。

將預培養后的南林895楊外植體浸入重懸液中輕晃振蕩15 min，用無菌濾紙吸去葉片上多余的菌液，平鋪于分化培養基(MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+TDZ 0.002 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 6.5 g·L-1)上，待分化篩選培養基(分化培養基 + Kan 40 mg·L-1+ 頭孢 200 mg·L-1+ 特美汀 200 mg·L-1)上長出狀態較好的抗性芽后，轉至芽伸長篩選培養基(芽伸長培養基 + Kan 20 mg·L-1+ 頭孢 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)，最后轉移至生根篩選培養基(生根培養基 + Kan 10 mg·L-1+ 頭孢 100 mg·L-1+ 特美汀 100 mg·L-1)上，于22 ℃培養溫度、4 000 lx光強、每天16 h光照的條件下溫室培養，最后獲得完整抗性植株。

利用PCR對初步篩選出來的抗性植株進行再次篩選，以陽性質粒為正對照，未轉基因南林895楊為負對照進行分子檢測。

1.6 光合速率相關參數的測定

在2016年6月采用GFS-3000(便攜式氣體交換熒光測定儀)測定轉PtRCA基因南林895楊和對照的光合速率相關參數。選擇與對照(3株)相同時間移栽、長勢良好且無病蟲害的盆栽轉基因植株30株(每個株系3株)作為樣本，測定時采用樹冠中部外圍著生于枝條頂端的3～5對生長健壯的葉片。每個株系共測3片，每個處理重復5次。單次測定在15 min內完成。

1.6.1 光合速率(Pn)日變化 晴朗無云條件下，在7： 00—19： 00之間，每隔1 h測定1次光合速率值，選用植株頂端的3對葉片，每株測定3片，重復記錄5次。

1.6.2 光合作用對光響應 晴朗無云條件下，光合有效輻射在0～1 400 μmol·m-2s-1范圍內設定若干梯度，測定光合速率值。測定時，葉室溫度30 ℃，葉室CO2濃度350 μmol·mol-1(與大氣中CO2濃度相同)，相對濕度60%； 相關參數通過回歸分析獲得。

1.6.3 光合作用對CO2響應 晴朗無云條件下，CO2濃度在0～1 000 μmol·mol-1范圍內設定若干梯度，測定光合速率值。測定時，葉室溫度30 ℃，光合有效輻射1 200 μmol·m-2s-1，相對濕度60%； 相關參數通過回歸分析獲得。

1.7 葉綠素熒光參數的測定

在2016年8月采用GFS-3000(便攜式氣體交換熒光測定儀)測定葉綠素熒光參數，選擇與對照(長勢最好的1株)相同時間移栽、長勢良好且無病蟲害的轉PtRCA基因南林895楊10株(每個株系中長勢最好的1株)作為樣本，測定時采用樹冠中部外圍著生于枝條頂端的第3對生長健壯的葉片，每個數值均重復測5次。

在光照強度300 μmol·m-2s-1條件下， 葉片暗適應20 min后再將光照強度增至1 800 μmol·m-2s-1，在2種光強條件下測定PSⅡ原初光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ的實際光化學效率(Fv′/Fm′)、光化學猝滅(qP)、非光化學猝滅(qN)等葉綠素熒光參數。1.8 數據處理

采用Excel軟件進行數據處理和圖表繪制，采用SAS統計軟件的Duncan法進行處理間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 楊樹PtRCA基因序列分析

根據已有的PtRCA基因序列的保守區，設計5′端及3′端特異引物，進行D-TOPO PCR轉化，通過藍白斑篩選挑選白色陽性克隆，經過菌落PCR，所有菌樣結果均出現目的條帶； 將測序結果通過NCBI中BLAST，與克隆的毛果楊PtRCA蛋白序列進行對比，發現克隆片段與楊樹預測片段相一致，具完整閱讀框。將PtRCA基因序列在GenBank中登錄，獲得登錄號為KY307834。

通過3次獨立的測序，PtRCA基因編碼序列(CDS)長1 323 bp，編碼區包含440個氨基酸，利用ProtScale對PtRCA基因編碼區CDS結構域分析，發現楊樹RCA蛋白N-末端存在1個轉運肽結合位點，含有AAA+家族蛋白保守區P-loop NTPase 超家族結構域，以及2個ATP結合域、1個ATPase響應結合域(圖1)。

圖1 PtRCA基因編碼區推測的核苷酸序列以及氨基酸序列Fig.1 Nucleic acid sequence and amino acid sequence of PtRCA粗實線區表示N-末端； 箭頭表示轉運肽結合位點； 陰影區表示AAA+家族蛋白保守區； 雙實線且加框表示ATP結合域； 加框表示ATPase sensor 2 motif； 左邊數字表示核苷酸數字。Heavy line area refers to N-terminal; The arrow refers to transit peptide binding sites; The shadow area refers to the conservative district of AAA+; Double solid line and framed area refers to ATP domain; Framed area refers to ATPase sensor 2 motif; The number refers to the number of nucleotides.

利用ExPASy ProtParam在線分析PtRCA的理化特性： PtRCA蛋白分子式為C2135H3367N579O656S21，相對分子質量為48 315.9 Da。共包括440個氨基酸，主要氨基酸為Asp,Glu,Arg,Lys，正電荷殘基數為49，負電荷殘基數為53，等電點pI為5.57。 不穩定指數為33.4，屬于穩定性蛋白。脂肪系數為77.55，平均親水系數為-0.311，為疏水性蛋白。

2.2 楊樹PtRCA基因蛋白同源性及系統進化分析

利用MAGA 5.0軟件結合NCBI同源蛋白序列搜索結果構建進化樹以分析楊樹PtRCA基因與其他物種RCA基因親緣關系，選取的物種分別為擬南芥、大豆(Glycinemax)、葡萄(Vitisvinifera)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、小籽海紅豆(Adenantheramicrosperma)、桃(Amygdaluspersica)、薺菜(Capsellabursa-pastoris)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)、南芥(Arabis)、水田碎米薺(Cardaminelyrata)，楊樹PtRCA蛋白與擬南芥、麻瘋樹、大豆等具較高同源性，應具備與其相似功能，這為楊樹PtRCA蛋白功能分析奠定了良好基礎。同時，將楊樹PtRCA基因編碼的蛋白與楊樹中其他蛋白質序列進行同源比對，并分析與PtRCA基因編碼的蛋白同源性較高的蛋白，發現其均屬于AAA+超級蛋白家族。這些都對PtRCA基因表達模式分析提供了參考依據。

2.3 楊樹RCA基因溫度梯度脅迫誘導表達

利用qRT-PCR檢測南林895楊(非轉基因)的RCA基因溫度梯度脅迫誘導表達情況，結果(圖2)顯示： 10 ℃低溫處理1天后，RCA基因表達量下降； 處理3天表達量極顯著提高，隨后顯著下降； 處理9天，表達量也顯著提高。20 ℃處理，RCA基因表達量基本呈現穩定上升趨勢。30 ℃高溫處理1天后，表達量顯著升高，3天后顯著下降，5天后表達量逐步上升。具較高耐熱性的RCA轉基因植株，受到中度熱脅迫時，仍具有較高的光合速率以及生產量，故提高植物RCA熱穩定性可作為改善植物抵御高溫脅迫的一種可行性方案(Kureketal., 2007)。

圖2 溫度脅迫下RCA基因表達模式分析Fig.2 Real-time PCR results of RCA expression under diverse temperature stresses

實時定量分析(圖3)顯示高溫(37 ℃)處理2 h后，RCA基因表達量顯著上調，隨后逐步降低，在高溫處理12 h后，表達量達到最低，甚至于不表達。而在經過22 ℃室溫恢復處理后，RCA基因表達量開始呈線性上升趨勢，且在恢復處理12 h時，RCA表達量超過了未經高溫處理的初始表達量。這說明適度高溫處理可誘導RCA表達(Wangetal., 2010)，這為推測RCA具耐高溫能力提供了依據。

圖3 37 ℃高溫誘導RCA基因表達模式分析Fig.3 Real-time PCR results of the expression of RCA induced by 37 ℃*，P < 0.05; **，P<0.01.

2.4 載體的構建

目的基因先經過BP反應整合到入門載體，再經過LR反應，整合到表達載體pGWB 406上，通過PCR凝膠電泳，結果顯示目的基因成功構入表達載體。

2.5 轉PtRCA基因南林895楊的獲得

待分化篩選培養基上長出狀態較好的抗性芽后，需及時轉移至芽伸長篩選培養基上，于22 ℃培養溫度、4 000 lx光強、每天16 h光照的條件下溫室培養。每隔10～15天，更換1次培養基，并實時觀察其生長狀況。

待抗性芽生長至3 cm高時，需及時轉移至生根篩選培養基上，于22 ℃培養溫度、4 000 lx光強、每天16 h光照的條件下溫室培養，最后獲得轉PtRCA基因南林895楊(圖4)。

圖4 轉PtRCA基因南林895楊的獲得Fig.4 Obtaining of PtRCA transgenic ‘Nanlin895’ poplarA： 葉盤分化； B: 抗性芽伸長； C： 抗性芽的壯大； D： 抗性植株。A: Leaf differentiation; B: Resistant shoot elongation; C. Resistant shoot growing; D. Transgenic plant.

利用PCR分子檢測對初步篩選出來的抗性植株進行再次篩選，以陽性質粒為正對照，未轉化南林895楊為負對照，顯示部分結果(圖5)，PCR擴增出的特異條帶與陽性對照一致，本試驗共篩選出14個株系為陽性。

圖5 轉PtRCA基因南林895楊PCR分子檢測電泳結果Fig.5 Electrophoresis results for PCR molecular detection of PtRCA transgenic ‘Nanlin895’ poplarM： DL 2000 marker. 1-4: 轉基因楊樹(sGFP表達載體片段)； -CK： 野生型； +CK： 陽性質粒。1-4： Transgenic lines; -CK: Negative control; +CK: Positive control.

2.6 高溫脅迫下轉PtRCA基因南林895楊與對照RCA基因表達比較分析

以室溫(22 ℃)正常生長且未轉化植株(南林895楊)組培苗為對照組，對生長45天的轉PtRCA基因南林895楊和未轉化植株(南林895楊)的組培苗進行高溫脅迫處理，每升高5 ℃設置1個處理溫度，37 ℃封頂，設置的3個高溫脅迫溫度為27，32，37 ℃，分別共同處理1，3，5天后，取組培苗頂端第3片葉進行采樣分析。

實時定量分析結果(圖6)顯示： 高溫處理1天后，27 ℃轉基因植株RCA基因表達量顯著上升，32，37 ℃處理植株RCA基因表達量均有所下降，未轉化植株RCA基因表達量為極顯著下降； 高溫處理3天后，所有處理植株RCA基因表達量均顯著上升，27 ℃處理的植株RCA基因表達量為極顯著上升，且轉基因植株RCA基因表達量是未轉化植株RCA基因表達量的2倍左右； 高溫處理5天后，所有處理植株RCA基因表達量均有所下降，其中27 ℃處理的轉基因植株RCA基因表達量極顯著高于對照組，32 ℃處理的轉基因植株RCA基因表達量也高于對照組，而37 ℃處理的轉基因植株RCA基因表達量與對照組持平。此外，任一高溫和時間處理下的轉基因植株RCA基因表達量均顯著高于未轉化植株RCA基因表達量。

圖6 高溫脅迫下南林895楊RCA基因表達模式分析Fig.6 Real-time PCR results of RCA expression in ‘Nanlin895’ poplar under high temperature stress*，P < 0.05; **，P<0.01.

2.7 光合速率相關參數的測定

2.7.1 轉PtRCA基因楊樹與對照的光合速率日變化規律比較 對光合速率日變化測定數據的分析表明(選取轉基因株系RCA1、RCA2、RCA6和對照進行對比分析)： 1)日變化曲線形態的不同： 對照植株的峰值出現在11： 00和14： 00，日變化呈雙峰曲線，最高凈光合速率(Pn)為12.7 μmol·m-2s-1左右，其低谷出現在12： 00—13： 00之間； 而3個轉PtRCA基因株系的平均峰值出現在12： 00，日變化基本呈單峰曲線，最高凈光合速率(Pn)為14.9 μmol·m-2s-1(RCA6)，平均持續1 h左右開始逐漸下降(圖7)。2)與對照相比，轉PtRCA基因楊樹在7： 00的凈光合速率(Pn)并無明顯差異，為3.9～4.3 μmol·m-2s-1之間。

根據上述分析，推測可能是由于PtRCA基因導入，改善了轉PtRCA基因楊樹的C3光合循環，并提高了轉基因植株利用強光的能力，使其充分利用強光進行光合作用； 相比之下，對照則出現明顯的光抑制現象。

圖7 轉PtRCA基因南林895楊和對照凈光合速率(Pn)的日變化Fig.7 Diurnal change of net photosynthetic rate(Pn) between transgenic poplars and controlRCA1,RCA2,RCA6: 轉基因株系Transgenic lines.下同。The same below.

2.7.2 轉PtRCA基因楊樹與對照的光合作用對光響應曲線的比較 光合作用對光的響應測定數據(選取轉基因株系RCA1、RCA2、RCA6和對照進行對比分析)表明： 光照強度0～400 μmol·m-2s-1時，轉PtRCA基因楊樹與對照的凈光合速率均呈線性增長，并隨著光照強度的不斷增加逐漸達到飽和狀態(圖8)。因此，依據凈光合速率與0～400 μmol·m-2s-1范圍內光照強度呈線性關系，建立10個轉基因株系和對照的直線回歸方程，計算出光飽和點、光補償點、表觀量子效率、暗呼吸速率以及光飽和時的光合速率(表3)。結果表明： 1)光飽和點： 轉PtRCA基因楊樹所有株系的光飽和點均比對照高，增加約12.5%～37.5%，其中8號株系的光飽和點最高。這表現出轉PtRCA基因楊樹能夠更好地利用強光進行光合作用。2)光補償點： 轉PtRCA基因楊樹(除3號株系外)的光補償點均略低于對照楊樹。這表明轉PtRCA基因楊樹具有較強的利用弱光能力。3)表觀量子效率： 轉PtRCA基因楊樹(除2號和6號株系外)的表觀量子效率均略高于對照楊樹。這表明轉PtRCA基因楊樹的光合作用更加活躍。4)暗呼吸速率： 轉PtRCA基因楊樹(除3號和9號株系外)的暗呼吸速率均略低于對照楊樹。這表明轉PtRCA基因楊樹在沒有光照時消耗的能量偏少。5)光飽和時的光合速率： 轉PtRCA基因楊樹在光飽和點時的光合速率比對照增高24.6%～55.7%(1號和2號株系的光合速率最高)。這進一步表明高光強能夠提高轉基因植株的羧化反應能力，使光合速率得到提高。

2.7.3 轉PtRCA基因楊樹與對照的光合作用對CO2濃度響應曲線的比較 光合作用對CO2濃度響應測定數據(選取轉基因株系RCA1、RCA2、RCA6和對照進行對比分析)表明： CO2濃度0～400 μmol·mol-1時，轉PtRCA基因楊樹和對照的凈光合速率呈線性增長，并隨著CO2濃度的不斷增加逐漸達到飽和狀態(圖9)。因此，依據凈光合速率與0～400 μmol·mol-1范圍內CO2濃度呈線性關系，建立10個轉基因株系和對照的直線回歸方程，計算出CO2飽和點、CO2補償點、羧化效率、光呼吸速率、CO2飽和時的光合速率(表4)。結果表明： 1)CO2飽和點： 轉PtRCA基因楊樹CO2飽和點除1號和4號株系外，其他均比對照低12.5%～25.0%，在略高于大氣CO2濃度下就達到飽和。2)CO2補償點： 轉PtRCA基因楊樹的CO2補償點比對照大幅度降低，低53.1%～80.4%。這表明由于PtRCA基因的導入，轉基因植株對CO2親和力較高，這也是轉基因植株CO2飽和點低的原因。3)羧化效率： 轉PtRCA基因楊樹的羧化效率均略高于對照。這表明轉PtRCA基因楊樹的羧化效率較強，能更好地催化RuBP進行羧化反應。4)光呼吸速率： 轉PtRCA基因楊樹的光呼吸比對照低37.7%～79.3%。這表明轉PtRCA基因楊樹有利于光合作用有機物積累，光呼吸消耗較少，其生物量增加。5)CO2飽和時的光合速率： 轉PtRCA基因楊樹在CO2飽和點時的光合速率比對照增加4.4%～26.4%(2號株系的光合速率最高)。轉基因植株在CO2飽和點較低的情況下，光合速率卻比對照高，這也進一步說明轉基因植株有較強的羧化反應能力，光合速率能夠得到提高。

圖8 轉PtRCA基因楊樹和對照的光合響應變化Fig.8 Changes of photosynthetic response between transgenic poplars and the control設定條件： 葉室溫度30 ℃，葉室CO2濃度350 μmol·mol-1，相對濕度60%。Testing conditions: Hamuro temperature of 30 ℃, Hamuro CO2 concentration of 350 μmol·mol-1, relative humidity of 60%.

表3 轉PtRCA基因楊樹和對照的光合響應參數指標Tab. 3 Index of photosynthetic response parameters of transgenic poplar and the control

2.8 葉綠素熒光參數的比較

2.8.1 轉PtRCA基因楊樹與對照的PSⅡ原初光化學效率(Fv/Fm)和實際光化學效率(Fv′/Fm′)比較 由表5的數據進行對比分析可知： 1)PSⅡ原初光化學效率(Fv/Fm)： 在低光照強度下，與對照相比，轉PtRCA基因楊樹的Fv/Fm沒有明顯差異； 而經過光氧化處理后，Fv/Fm均存在不同程度的降低； 相比較而言，對照下降得最多，為61.7%，轉基因楊樹下降45.0%～53.1%(4號株系下降得最少，為45%)。2)PSⅡ實際光化學效率(Fv′/Fm′)： 在低光照強度下，轉PtRCA基因楊樹和對照的Fv′/Fm′沒有明顯差異； 然而經過光氧化處理后，二者的Fv′/Fm′均有不同程度的降低，對照下降得最多，為54.1%，而轉PtRCA基因楊樹下降38.7%～52.0%(6號株系下降得最少，為38.7%)。這表明轉PtRCA基因植株利用吸收的光子的能力較強，吸收的光子供給PSⅡ反應中心的效率較高，推測這可能是由于PtRCA基因的導入，提高植株PSⅡ反應中心的效率。

圖9 轉PtRCA基因楊樹和對照在不同CO2濃度下的光合響應Fig.9 Photosynthetic response to CO2 concentration between transgenic poplars and the control設定條件： 葉室溫度30 ℃，光照強度1 200 μmol·m-2s-1，相對濕度60%。Testing conditions: Hamuro temperature of 30 ℃, light intensity of 1 200 μmol·m-2s-1, relative humidity of 60%.

表4 轉PtRCA基因楊樹和對照的CO2光合響應參數指標Tab.4 Index of photosynthetic response to CO2 concentration between transgenic poplars and control

2.8.2 轉PtRCA基因楊樹與對照的光化學猝滅(qP)和非光化學猝滅(qN)比較 由表6的數據進行對比分析可知： 1)光化學猝滅系數(qP)： 在低光照強度下，轉PtRCA基因楊樹與對照的qP沒有明顯差異； 經過光氧化處理后，二者的qP均下降，對照下降了68.3%，而轉基因楊樹下降較少，為51.0%～65.8%(2號株系下降的最少，為51.0%)。這表明在強光下，與對照相比，轉PtRCA基因楊樹的光化學電子傳遞比較順暢，用于光化學電子傳遞的光能份額比較高，而對照出現了明顯的受阻現象。2)非光化學猝滅系數(qN)： 在低光照強度下，轉PtRCA基因楊樹與對照的qN沒有明顯差異； 經過光氧化處理后，對照增加僅為3.0%，而轉PtRCA基因楊樹增加較多，為6.0%～26.5%(2號株系增加的最多，為26.5%)。這表明PtRCA基因的導入，使得轉PtRCA基因楊樹的光合機構沒有受到破壞，過剩光能得到較好的耗散，表現出較好的耐光氧化能力。

表5 轉PtRCA基因楊樹和對照的PSⅡ原初光化學效率(Fv/Fm)和實際光化學效率(Fv′/Fm′)在不同光強下的比較①Tab.5 PS Ⅱ primary photochemical efficiency (Fv/Fm) and PSⅡ actual photochemical efficiency (Fv′/ Fm′) in different light intensity between transgenic poplars and control

① 平均值±標準偏差(5組數據)。Mean ±SD (n=5).

表6 轉PtRCA基因楊樹和對照的光化學猝滅(qP)和非光化學猝滅(qN)在不同光強下的比較①Tab.6 Photochemical quenching (qP) and non-photochemical quenching (qN) in different light intensity between transgenic poplars and the control

① 平均值±標準偏差(5組數據)。Mean±SD (n=5).

3 討論

高光強一直是抑制植物生長、降低光合速率的主要因素，然而，近幾年一系列研究表明： Rubisco活化酶(RCA)具抵御高光強脅迫的作用，這為培育高產量抗逆植株提供了理論依據。

3.1 轉PtRCA基因南林895楊與其他轉RCA基因植物的比較分析

在研究擬南芥Rubisco活化問題時首先發現RCA，經過對RCA進行一系列抗體研究，發現它存在于高等植物及一些單細胞光合生物中，這說明在光合生物中，RCA對Rubisco活性調節機制普遍存在，RCA與光合作用有著密切關系(Hasseetal., 2015)。

利用農桿菌遺傳介導獲得了RCA基因正義擬南芥，結果顯示僅表達大亞基的正義植株各項指標與野生型并無明顯差異，而只表達小亞基的正義轉化苗長勢明顯優于野生型(Zhangetal., 2002)。同樣，相似正義遺傳轉化試驗結果顯示，轉小亞基正義植株長勢顯著優于野生型植株，另外，該研究發現RCA與GA信號傳導有密切聯系(Sharmaetal., 2002； Wangetal., 2010)。雖然以上試驗均表明RCA基因主要是由小亞基表達功能，但對獲得的正義水稻研究表明，轉大亞基植株的Rubisco活性、光合效率指標均明顯高于野生型，作物產量也有所提高(Wuetal.， 2007)。這些研究為通過基因工程，增強植物的抗逆性，進而提高植物光合速率和產量提供了新的思路。研究轉基因水稻RCA基因調控時，發現RCA對葉綠體的發育有調節作用，且在水稻發育生長后期，轉基因植株葉片中RCA含量一直偏高，隨著葉片的衰老，RCA含量逐步降低，光合速率下降，說明植物光合速率受RCA影響，RCA對凈光合速率起重要調控作用(蔣德安等, 2000； 翁曉燕等, 2001； 張國等, 2005)。

本研究嘗試利用轉基因技術使毛果楊PtRCA基因在楊樹中高效表達，通過PtRCA基因的特性，使Rubisco處于穩定的催化活性狀態，讓Rubisco更加有效地參與到光合碳同化過程中。本研究結果也表明，克隆得到的PtRCA基因蛋白與擬南芥等RCA蛋白同源性較高，可作為研究楊樹PtRCA蛋白功能的參考依據。分析證實了RCA具耐高溫耐熱能力, 轉PtRCA基因楊樹能夠充分利用中午的強光進行光合作用，利用CO2的能力較強，能更好地催化RuBP進行羧化反應，羧化效率較強。在強光下，轉PtRCA基因楊樹的光合機構沒有受到破壞，過剩光能得到較好的耗散，表現出一定的耐光氧化能力。

上述結果表明具較高耐高溫耐熱性的RCA轉基因植株，受到中度熱脅迫時，仍具有較高的光合速率以及生產量。這與在研究擬南芥轉基因植株時，發現RCA對凈光合速率熱恢復具重要作用(Kureketal., 2007)等相關研究結果一致。這為利用轉基因手段進行楊樹新型高光效抗逆新品種的研究提供了重要依據。

3.2 轉PtRCA基因南林895楊與轉PEPC基因(C4植物)南林895楊的比較分析

與C3植物只利用卡爾文循環中1，5-二磷酸核酮糖直接固定CO2相比，C4植物首先利用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，經PEP羧化酶(PEPC)的作用與CO2結合，形成蘋果酸或天門冬氨酸。這些四碳雙羧酸轉移到鞘細胞里，通過脫羧酶的作用釋放CO2，后者在鞘細胞葉綠體內經核酮糖1，5-二磷酸(RuBP)羧化酶作用，進入卡爾文循環。因為PEP與CO2的結合能力遠遠大于RuBP，這使得C4植物即使在CO2濃度比較低的時候，依然可以通過這一點源源不斷為光合作用提供充足的CO2，使得C4植物光合作用也較強。因此，通過分子技術讓C3植物與C4植物一樣，具有更加高效的光合作用已成為現今研究的熱門課題(Leegood, 2013)。

據報導，水生植物Egeriadensa和Hydrillaverticilata體內也發現有C4光合途徑，這一發現很大程度上預示著，或許可以通過C4光合酶基因向C3植物的遺傳轉化從而提高C3植物光合作用的可操作性(Tengetal., 2001； Lietal., 2005)。作者利用農桿菌介導法，將光合作用C4途徑關鍵酶基因PEPC導入楊樹并進行相關特性的分析，其研究結果(尹吳等， 2012)與本研究相比： 轉PEPC基因楊樹具有C4植物的某些高光效特性，在光合速率、光能利用效率、羧化效率等方面的表現與其對照相比具有一定的優勢，這些表現在一定程度上優于本試驗中轉PtRCA基因株系對應的數據； 然而，在耐光氧化方面，轉PtRCA基因楊樹比轉PEPC基因楊樹具有更加明顯的優勢。上述對比說明PEPC基因能夠更好地固定CO2，對CO2的親合力較強，從而促使磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)固定大氣中濃度較低的CO2，供C3途徑利用，因此轉PEPC基因楊樹的羧化效率更高，利用CO2的能力更強，而RCA基因具有很強的耐高溫抗高光強的特性。

4 結論

轉PtRCA基因楊樹具有較高的凈光合速率，推測是由于PtRCA基因的導入，提高了轉PtRCA基因楊樹利用強光的能力，使其能夠充分利用中午的強光進行光合作用。轉PtRCA基因楊樹所有株系的光飽和點較高，且在光飽和點時的光合速率較高。這說明轉PtRCA基因楊樹能夠較好地利用強光進行光合作用。轉PtRCA基因楊樹CO2飽和點較低(除1號和4號株系外)； 而在CO2飽和點時的光合速率，轉PtRCA基因楊樹較高； 此外，轉PtRCA基因楊樹的羧化效率較高。這些均表明轉PtRCA基因楊樹利用CO2的能力較強，能夠更好地催化RuBP進行羧化反應，羧化效率較強。

轉PtRCA基因楊樹利用吸收的光子的能力較強，吸收的光子供給PSⅡ反應中心的效率較高，推測這可能是由于PtRCA基因的導入提高了PSⅡ反應中心的效率。在高光照強度下，與未轉基因對照相比，轉PtRCA基因楊樹的光化學電子傳遞比較順暢，其PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額較高，且轉PtRCA基因楊樹表現出耐光氧化的能力，其過剩光能量得到較好的耗散。

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(責任編輯 徐 紅)

Cloning and Functional Analysis of Rubisco Activase Gene fromPopulustrichocarpa

Yin Wu Sun Weibo Zhou Yan Zhuge Qiang

(KeyLaboratoryofForestGenetics&BiotechnologyofMinistryofEducationCo-InnovationCenterforSustainableForestryinSouthernChinaNanjingForestryUniversityNanjing210037)

【Objective】 Ribulose-1,5-bishosphate (Rubisco) is the key enzymes in the first step of carbon assimilation involved in plant photosynthesis. Rubisco was kept in a catalytic active state under the control of Rubisco activase(RCA), as a result, the efficiency of photosynthesis will be improved. In this research, thePtRCAgene of poplars was cloned. Transgenic poplars with high expression ofPtRCAwere obtained through this research. As a result, a new type of high efficiency photosynthesis with stress tolerance was proved to be feasible through the analysis of molecular detection and functional analysis. 【Method】According to the sequence ofPtRCAgene cloned fromPopulustrichocarpa, the analysis of function and structure ofPtRCAwere conducted through Bioinformatics software.PtRCAwas constructed into the expression vector pGWB406 by usingAgrobacteriummediated method. ‘Nanlin895’poplar plants (P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin895’) were used in this research. Gene expression of both transgenic poplars and ‘Nanlin895’plants were compared under high temperature stress. The parameters of photosynthesis and chlorophyll fluorescence were compared between them as well. 【Result】The CDS sequence ofPtRCAwas 1 323 bp. There were 440 amino acid residues, and protein molecular weight is 48 315.9 Da. The isoelectric point is 5.57, which is hydrophobic protein without signal peptide and membrane structure.PtRCAis proved to be in the same AAA+ family according to the result of sequence comparison. It has same RCA homology protein with soybean and arabidopsis as well. The expression quantity of transgenic poplars were higher than ‘Nanlin895’ in average. Transgenic poplars showed advantage of photosynthesis during the noon, the light saturation point was 12.5% to 37.5% higher. Moreover, the efficiency of photosynthesis was 24.6% to 55.7% higher than the plants used as control. However, the light compensation point is lower than that of plants without transgenosis expect the No.3 strain. Besides, the usage of CO2and the carboxylation efficiency of the transgenic poplars were better. Expect No.1 and No.4 strains, CO2saturation point was around 12.5%-25.0% less than control plants. CO2compensation point and light respiration were proved to be 53.1%-80.4% and 37.7%-79.3% lower compared to the controls respectively. Moreover, the efficiency of photosynthesis at the CO2saturation point was around 4.4%-26.4% higher. The tolerance of transgenic poplars to light oxidation was increased according to this research. Under the light oxidation treatment, the primary photochemical efficiency of PSⅡ decreased 61.7% in control lines. And transgenic poplar decreased by 45.0%- 53.1%.The actual photochemical efficiency of PSⅡ in controls decreased 54.1%. And transgenic poplar decreased by 38.7%-52.0%.Photochemical quenching coefficient dropped 68.3%, and 51.0%-65.8% declined in transgenic poplars. Non photochemical quenching coefficient increased by 3.0% compared to the control, and 6.0%-26.5% increased in transgenic poplars.【Conclusion】 Poplar Rubisco activase (PtRCA) protein and soy protein,ArabidopsisthalianaRCA homology is higher. According to the real-time quantitative PCR and related physiological analysis, transgenic poplars (P.deltoides×P.euramericana‘Nanlin895’) showed high-temperature resistance, higher efficiency of photosynthesis, increased ability to use CO2and better catalyzing effect on carboxylation reaction. The efficiency of assimilating photons and supplying to PSⅡ was highly developed, and as a result, the light oxidation ability of transgenic poplars was proved to be enhanced. The efficiency of photosynthesis was improved by high expression ofPtRACgene in transgenic poplars, which also showed ability to adjust for high temperature and strong light.

Populus; Rubisco activase gene; transgenic; photosynthesis

10.11707/j.1001-7488.20170410

2016-09-20；

2016-12-10。

國家科技部“863計劃”課題(2013AA102703); 國家國際科技合作專項(2014DFG32440); 國家自然科學基金項目(31570650); 江蘇省高校優勢學科建設工程項目(PAPD)。

S718.46； S718.43

A

1001-7488(2017)04-0083-13

*諸葛強為通訊作者。