香菇轉(zhuǎn)色前后Atg8表達的變化規(guī)律研究*

房麗麗，楊 麗，李翠新，劉慶洪**

（1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2.中國農(nóng)業(yè)大學生物學院，北京 100094）

香菇轉(zhuǎn)色前后Atg8表達的變化規(guī)律研究*

房麗麗1，2，楊 麗2，李翠新1，劉慶洪2**

（1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2.中國農(nóng)業(yè)大學生物學院，北京 100094）

比對香菇（Lentinula edodes）Atg8蛋白基因的同源序列，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR確定香菇Atg8的外顯子序列。構(gòu)建其表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plyS獲得其表達菌株。采用鎳柱和MonoQ純化表達的Atg8蛋白，成功制備兔多隆抗體。通過western－blotting對轉(zhuǎn)色前后Atg8蛋白的表達量進行對比。香菇Atg8蛋白基因長度為603 bp，Atg8蛋白分子量25 kDa左右，且為可溶性蛋白。轉(zhuǎn)色后的香菇Atg8蛋白雜交條帶較微弱，而轉(zhuǎn)色前雜交條帶幾乎沒有。表明轉(zhuǎn)色后的香菇菌絲Atg8表達量比轉(zhuǎn)色前含量高。

香菇；轉(zhuǎn)色；自噬；Atg8

自噬（Autophagy）是通過包裹蛋白質(zhì)、受損或破壞的細胞器，運送到溶酶體并降解，再釋放到細胞質(zhì)的過程。自噬分為3種：巨自噬、微自噬、分子伴侶介導自噬[1]。本文未特殊說明均為巨自噬（簡稱自噬）。自噬參與多種生理和病理活動，是生命活動中必不可少的代謝過程[2]。自噬蛋白（Autophagyrelated gene,ATG）Atg8是自噬過程的核心[3]，其是自噬過程中保守的編碼蛋白，故用Atg8作為自噬過程的指示蛋白[4－6]。目前自噬的研究主要集中在酵母、線蟲、哺乳動物等，針對大型真菌方向的研究鮮見報道。

轉(zhuǎn)色是香菇（Lentinula edodes） 生長過程中很重要的過程。轉(zhuǎn)色的好壞直接關(guān)系到香菇的產(chǎn)量與品質(zhì)[7－8]。目前香菇轉(zhuǎn)色的相關(guān)研究主要集中在菌絲的長勢、溫度、光照、濕度等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，碳元素與氮元素的比值直接影響香菇的轉(zhuǎn)色[10]，而碳元素與氮元素的比值改變（營養(yǎng)缺乏）又可以誘導自噬[11]。本研究探索香菇轉(zhuǎn)色前后自噬Atg8蛋白是否存在差異，確定香菇轉(zhuǎn)色與自噬之間是否存在聯(lián)系，進一步探討香菇轉(zhuǎn)色的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇（Lentinus edodes） 菌種來自香港中文大學，菌種編號L54。

香菇菌棒來自北京順義、懷柔、密云、房山等地。1.2 主要試劑

1.2.1 香菇菌絲總蛋白質(zhì)提取液

香菇菌絲總蛋白質(zhì)提取液的pH為7.5。

1.2.2 相關(guān)酶和抗體

TAQ DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自TAKARA公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；DNA和RNA提取試劑盒均購自北京Biomed公司；M-MLVⅢReverse Transcriptasa購自Biomed公司；感受態(tài)細胞選用大腸桿菌 BL21（DE3）plyS，購自Biomed公司。

1.2.3 主要儀器

紫外分光光度計9100A，美國Labtech公司；快速蛋白液相色譜系統(tǒng)（FPLC），美國Amersham公司；MonoQ陰離子交換層析，美國GE公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；真空冷凍干燥機，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 香菇Atg8基因引物設計

使用primer premier5軟件設計引物。正向引物：5’-ATGAGGTCAAAGTTCAAGGACGAGC-3’，反向引物：5’-TCATGCATCCATCGGCAGCT-3’。

1.3.2 香菇DNA提取與Atg8克隆

根據(jù)試劑盒說明提取香菇基因DNA。

采用1%瓊脂糖電泳檢測DNA。PCR體系為50 μL，其中 0.25 μL TaKaRa Taq（5 unites·μL-1），5 μL 10×PCR buffer（Mg2+free），3 μL Mg2+，4 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），引物各1 μL，計算DNA模板終濃度小于500 ng·μL-1，補水至50 μL。反應程序：預變性95℃反應30 s，95℃反應0.5 min，56℃反應30 s，35個循環(huán)。

1.3.3 mRNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR

根據(jù)試劑盒說明提取香菇RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量。

第1條cDNA鏈合成體系：Total RNA終濃度50 ng·μL-1～5 μg·μL-1，1 μL的 Oligo（dT） 20（0.5 μg·μL-1），1 μL的10 mmol·L-1dNTPs，4 μL的5× RT Buffer，0.5 μL的Ribonuclease inhibitor（10 unites·μL-1），1 μL的M-MLV III補水至20 μL，輕輕混勻，50℃孵育50 min。85℃加熱15 min后MMLV III失活。PCR體系同上。

1.3.4 TA克隆

使用 TAKARA公司的“pMDTM19-T Vector Cloning Kit”進行TA克隆。

1.3.5 限制性內(nèi)切酶酶切反應

Atg8片段在37℃酶切3 h。酶切后用1%的瓊脂糖電泳進行回收，酶切體系為：20 μL的DNA片段，2 μL的EcoR I，2 μL的Xhol I，4 μL的10×H buffer，加入ddH2O補至50 μL。

pET30a質(zhì)粒在37℃酶切4 h，酶切后用1%的瓊脂糖電泳進行回收。酶切體系為：1 μL的pET30a，2 μL的 EcoR I，2 μL的 Xhol I，4 μL的 10×H buffer，加入ddH2O補至50 μL。

1.3.6 連接反應

插入片段與載體片段分子數(shù)的摩爾數(shù)比為7: 1，16℃連接過夜。連接體系：1 μL的 T4Ligase buffer，7 μL酶切后的目的片段，1 μL酶切后的載體，1 μL的T4Ligas，加水至10 μL。

1.3.7 表達菌株構(gòu)建

（1）大腸桿菌轉(zhuǎn)化

取2支感受態(tài)細胞放冰上融化后，分別加入1 μL的連接產(chǎn)物和1 μL的Pet-30a載體。冰上孵育30 min，42℃熱擊90 s后，冰浴2 min。加入500 μL新鮮的LB培養(yǎng)基。37℃，140 r·min-1培養(yǎng)45 min。吸取100 μL涂布在含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基上。37℃倒置培養(yǎng)過夜。

（2）構(gòu)建質(zhì)粒鑒定

提取單菌落至20 mL含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，170 r·min-1培養(yǎng)8 h左右，進行菌落PCR。1%瓊脂糖電泳檢測，與目的條帶大小比較。委托公司進行測序，測序結(jié)果正確。確定構(gòu)建正確的質(zhì)粒。

（3）質(zhì)粒提取與菌種保存

將含有正確載體的菌接到100 mL的含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，采用博邁德質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。將菌液離心后加入終濃度為20%的甘油，-80℃保存。

1.3.8 Atg8在大腸桿菌中誘導表達

用牙簽沾取少量的表達菌株到20 μL含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，170 r·min-1活化過夜。將活化的菌液吸取400 μL到20 mL含有硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，170 r·min-1培養(yǎng)至菌液在600 nm波長處OD值為0.6～0.8。加入IPTG，37℃，170 r·min-1誘導培養(yǎng)2 h。含有pET30a的大腸桿菌作為陰性對照。取2 mL菌液離心后收集菌體上清，用SDS-PAGE檢測表達是否成功。5 000 r·min-1，4℃離心15 min，獲取菌株。用lysis buffer洗滌菌體1次，離心。超聲波破碎細胞，9 000 r·min-1，4℃離心15 min，收集上清和沉淀。SDSPAGE檢測目的蛋白質(zhì)。

1.3.9 鎳柱親和層析

收集超聲破碎上清液用不同濃度咪唑、100 mmol·L-1NaCl、50 mmol·L-1Tris-HCl（pH8.8）緩沖液進行洗脫，每管280 nm波長處檢測OD值。繪制洗脫曲線。SDS-PAGE確定目的蛋白純度。

1.3.10 MonoQ陰離子交換層析純化

采用20 mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0）為A液、1 mol·L-1NaCl和20 mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0）為B液，進行線性洗脫收集洗脫液。繪制洗脫曲線。SDS-PAGE確定目的蛋白純度。

1.3.11 兔多隆抗體制備

Atg8的兔多隆抗體委托華大公司進行制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇自噬Atg8基因序列比對

不同香菇的自噬基因Atg8序列比對結(jié)果見圖1。

如圖1所示，香港中文大學關(guān)海山教授提供的自噬Atg8序列和香菇L54菌絲自噬Atg8序列、與市售香菇的Atg8序列比對一致性高達94.32%。因此，香港中文大學關(guān)海山教授提供的自噬Atg8序列可以用于本實驗研究。

2.2 香菇自噬Atg8蛋白的同源性

自噬Atg8蛋白的同源性比較見圖2。

圖1 不同香菇的自噬基因Atg8的序列比對結(jié)果Fig.1 Comparison of autophagy gene Atg8 sequence of different Lentinula edodes

圖2 自噬Atg8蛋白的同源性Fig.2 Homology of autophagy Atg8 protein

從圖2可以看出，香菇L54菌絲提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR后，再經(jīng)DNAMAN預測蛋白質(zhì)序列；將其預測的蛋白序列與NCBI上已有的平菇自噬Atg8蛋白序列、雙孢菇自噬Atg8蛋白序列及釀酒酵母自噬Atg8蛋白序列，應用DNA MAN軟件比對各Atg8蛋白結(jié)果一致性高達91.14%，并且香菇的自噬Atg8蛋白序列與其他大型真菌的自噬Atg8蛋白同源性更高，說明自噬Atg8蛋白的保守性。

2.3 香菇Atg8在大腸桿菌中的表達與純化

2.3.1 香菇Atg8在大腸桿菌中的表達

大腸桿菌轉(zhuǎn)化前后Atg8蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖3。

圖3 大腸桿菌轉(zhuǎn)化前后Atg8蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of Atg8 protein before and after Escherichia coli transformation

圖3中a所示，香菇Atg8基因成功構(gòu)建pET30a重組質(zhì)粒，并順利轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）ply，再經(jīng)0.5 mmol·L-1IPTG誘導后能夠大量表達。

圖3中b所示，目的蛋白Atg8超聲破碎離心后存在于上清中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲破碎后得到的Atg8蛋白濃度更高，故目的蛋白為可溶性蛋白。

2.3.2 Atg8目的蛋白的純化

（1）鎳柱親和層析

鎳柱的洗脫曲線見圖4。鎳柱不同洗脫峰SDSPAGE檢測見圖5。

結(jié)合圖4與圖5可以看出，使用100 mmol·L-1咪唑+100 mmol·L-1NaCl+50 mmol·L-1Tris-HCl（pH8.8） 洗脫，以及在 150 mmol·L-1咪唑+100 mmol·L-1NaCl+50 mmol·L-1Tris-HCl（pH8.8） 鎳柱親和層析中都有目的蛋白Atg8被洗脫。圖5中有多條明顯的條帶，條帶不單一，證明經(jīng)鎳柱洗脫的目的蛋白Atg8含有雜蛋白。

圖4 鎳柱的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of nickel column

注：1：N1峰；2：N2峰；3和4：N3峰；5和6：N4峰；M：Marker。Note:1:N1 peak;2:N2 peak;3 and 4:N3 peak;5 and 6:N4 peak;M:Marker.

（2）MonoQ強陽離子交換層析

MonoQ洗脫曲線和MonoQ純化后SDS-PAGE檢測圖見圖6和圖7。

含有雜蛋白的Atg8蛋白再用MonoQ柱進一步純化后，通過SDS-PAGE檢測目的條帶的純度，圖7顯示目的Atg8蛋白條帶單一，證明2次純化后目的蛋白Atg8純度比較高。

圖6 MonoQ洗脫曲線Fig.6 MonoQ elution curve

圖7MonoQ純化后SDS-PAGE檢測圖Fig.7 SDS-PAGE resoult after purification with MonoQ

2.3.3 香菇Atg8兔多隆抗體的制備

香菇Atg8兔多隆抗體的制備檢測見圖8。

將純化后香菇Atg8蛋白經(jīng)華大公司制備兔多克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE檢測純度。從圖8可以看出，抗體純度很高，在50 kDa和25 kDa處呈現(xiàn)2條條帶，與lgG重鏈與lgG輕鏈相對應。將兔多隆抗體按1:10 000、1:5 000、1:2 000、1:1 000、1:500稀釋，將稀釋后的抗體與抗原雜交，二抗按說明書要求稀釋倍數(shù)，見圖9。

圖8 兔多抗體檢測Fig.8 Rabbit antibody testing

圖9 抗體最佳使用濃度檢測Fig.9 Antibody optimal concentration test

從圖9可以看出，稀釋倍數(shù)1∶1 000的雜交條帶較為明顯，故用此稀釋倍數(shù)進行實驗。

2.3.4 香菇轉(zhuǎn)色前后Atg8表達量的變化

香菇轉(zhuǎn)色前后情況對比見圖10。轉(zhuǎn)色前后免疫印跡結(jié)果見圖11。

為進一步確定香菇轉(zhuǎn)色前后Atg8蛋白有無變化，分別提取蛋白后與兔多克隆抗體進行雜交，如圖11所顯示的雜交條帶：轉(zhuǎn)色后條帶較微弱，轉(zhuǎn)色前條帶幾乎沒有，普通市售香菇子實體條帶顯示比較明顯。從這個結(jié)果可以說明香菇中含有Atg8蛋白，并且轉(zhuǎn)色后的菌絲中Atg8含量較轉(zhuǎn)色前高。也就是說轉(zhuǎn)色后菌絲自噬Atg8蛋白表達量高于轉(zhuǎn)色前香菇Atg8蛋白的表達量。因此，自噬可能參與了香菇轉(zhuǎn)色這一過程。

圖10 香菇轉(zhuǎn)色前后對比Fig.10 Comparison of Lentinula edodes before and after the color-turning

圖11 轉(zhuǎn)色前后免疫印跡結(jié)果Fig.11 Western-blotting results before and after color-turning

3 討論

自噬能夠降解損傷、喪失功能的細胞器和物質(zhì)，維持細胞內(nèi)更新和穩(wěn)態(tài)，與機體的多種生理和病理過程密切相關(guān)。營養(yǎng)缺乏可誘導自噬[12]，而營養(yǎng)缺乏同時引起香菇轉(zhuǎn)色[13]。香菇轉(zhuǎn)色是生產(chǎn)中獨特的1種現(xiàn)象，正常轉(zhuǎn)色直接關(guān)系到香菇生產(chǎn)中產(chǎn)量的高低、質(zhì)量的優(yōu)劣。

本研究成功克隆香菇Atg8蛋白，其基因序列長度為603 bp，目的蛋白分子量25 kDa左右。利用純化后Atg8蛋白成功克隆兔多隆抗體，與轉(zhuǎn)色前后總蛋白進行免疫印跡檢測。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)色前雜交條帶幾乎沒有，而轉(zhuǎn)色后雜交條帶比較微弱。但足以說明轉(zhuǎn)色后的菌絲自噬Atg8蛋白含量高于轉(zhuǎn)色前。也從另一方面說明自噬可能參與轉(zhuǎn)色過程。實驗中也存在一些不足：因從菌棒上剝離菌絲比較困難，導致提取的總蛋白含量較低，最終導致條帶不是很清晰。

香菇轉(zhuǎn)色直接影響香菇的品質(zhì)和質(zhì)量，但目前仍局限在調(diào)控物理性條件溫度、濕度、光照、營養(yǎng)因素等來控制香菇轉(zhuǎn)色[14-15]。物理性因素控制不好將影響香菇的轉(zhuǎn)色是否成功，從而進一步影響香菇的質(zhì)量和品質(zhì)。本次研究顯示自噬存在香菇轉(zhuǎn)色這一過程；首次成功將目的基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，且自噬Atg8蛋白能夠在大腸桿菌中成功表達。希望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加自噬基因的誘導表達，從而降低香菇轉(zhuǎn)色受溫度、濕度、光照、營養(yǎng)因素等外界環(huán)境的影響程度。

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Research on Color-turning Changes of Atg8 Protein Expression in Lentinula edodes

FANG Li-li1,2,YANG Li2,LI Cui-xin1,LIU Qing-hong2
(1.College of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China; 2.Biology College,China Agricultural University,Beijing 100094,China)

After comparison of Atg8 protein homologous sequences in Lentinula edodes genome,the atg8 sequence of L.edodes was determined by reverse transcription PCR.And then,the expression plasmids were constructed by restriction enzyme digestion.It was transformed into Escherichia coli BL21(DE3)plyS to obtain its expression strain.The expressed Atg8 protein was purified by nickel column and MonoQ,subsequently rabbit polyclonal antibody was successfully prepared.The expression of Atg8 protein was detected by western－blotting before and after the color－turning.The Atg8 gene of L.edodes was 603 bp in length and the molecular weight of Atg8 protein was about 25 kDa,which was soultable.Atg8 protein hybridization bands were weak in white L.edodes mycelium,while Atg8 protein bands were almost none in brown.The results showed that Atg8 protein content in brown mycelium of L.edodes was higher than that in white mycelium.

Lentinula edodes;color－turnning;autophagy;Atg8

S646.1

A

1003-8310（2017）03-0044-06

10.13629/j.cnki.53－1054.2017.03.011

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)業(yè)體系食用菌產(chǎn)業(yè)專項（CARS－024）。

房麗麗（1989－），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為藥用及食用真菌。E－mail:fanglili1224＠126.com

*通信作者：劉慶洪（1967－），男，博士，副教授，主要從事藥用及食用真菌研究。E－mail:qhliu＠cau.edu.cn

2017－03－22