豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的建立和初步應(yīng)用

高 駿,易建中,李 紅,劉成倩,姚惠娟,孫鳳萍

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106)

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是一種主要引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、新生仔豬先天性震顫(CT)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)等疾病的病原體[1]。PCV2還常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒病(PPV)、豬偽狂犬病毒(PrV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、多殺性巴氏桿菌(PM)、肺炎支原體(MP)等病原體形成混合感染[2-3],對養(yǎng)豬業(yè)的危害極大。

吳瑗等[4]對浙江省及周邊地區(qū)的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)進(jìn)行了分子流行病學(xué)的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)PCV2的陽性率在2007—2012年間分別為41.7%、52.0%、44.1%、37.0%、40.5%和33.3%。張智明等[5]對黑龍江多個地區(qū)2012—2014年間疑似PCV2的246份感染病料的分子流行病學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),PCV2陽性率為78.46%。以上研究表明,PCV2在我國的大小豬場中普遍存在。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi等[6]設(shè)計并報道。該技術(shù)依賴于Bst DNA聚合酶大片段的置換活性,利用4條特異性引物在60—65℃、1—2 h條件下完成對目標(biāo)片段序列的等溫擴(kuò)增。LAMP技術(shù)最終的擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳后的凝膠上呈現(xiàn)出片段長度不等的梯狀條帶組,擴(kuò)增得到的產(chǎn)物可以經(jīng)過酶切進(jìn)行驗證,也可以無需電泳直接肉眼進(jìn)行可視化的結(jié)果判斷。與普通的PCR檢測方法相比,LAMP省卻了DNA模板的熱變性、熱循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程,也不需要使用昂貴的PCR儀,使用簡單的水浴鍋或保溫杯即可進(jìn)行,該方法較適宜滿足基層單位的臨床快速診斷要求。本研究擬建立有效的PCV2 LAMP檢測方法,以期滿足基層臨床PCV2病原的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒毒株

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)全長陽性質(zhì)粒DNA及陽性毒株、豬偽狂犬病毒株(PrV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒株(PRRSV)、豬瘟病毒毒株(CSFV)、豬細(xì)小病毒毒株(PPV)均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病室分離和保存。

1.2 試劑

TIANamp Virus DNA∕RNA Kit、TIANamp Blood DNA Kit購自天根生化科技有限公司;Bst DNA聚合酶和BpiI(BbsI)內(nèi)切酶均購自紐英倫(NEB)生物技術(shù)(北京)有限公司;MgSO4、甜菜堿(Betaine)購自Sigma公司;dNTPs、DL 2000 marker等購自大連寶生物工程有限公司;GoldViewTM核酸染料購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中發(fā)布的PCV2全長基因組序列(AY686763),使用LAMP在線引物軟件設(shè)計工具h(yuǎn)ttps:∕∕primerexplorer.jp∕lampv4∕index.html設(shè)計1組LAMP引物,FIP引物在3’末端含有與F2c互補(bǔ)的F2區(qū)段,BIP引物在3’末端含有與B2c互補(bǔ)的B2區(qū)段。兩對引物均由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成,引物序列詳見表1。

表1 PCV2 LAMP擴(kuò)增引物信息Table 1 LAMP primer information for PCV2

1.4 病毒DNA的提取

利用TIANamp Virus DNA∕RNA Kit提取相關(guān)病原的DNA和RNA。使用TIANamp Blood DNA Kit提取上海與江蘇海門某豬場的疑似PCV2的血樣DNA。

1.5 PCV2 LAMP檢測方法的建立

對PCV2的LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,反應(yīng)總體系為25 μL,包括:1)Bst DNA聚合酶(8 U∕μL)1.25 μL;2)Bst緩沖液 2.5 μL;3)DNA 模版(PCV2 全長質(zhì)粒 DNA)1 μL(0.1 μg∕μL),其他反應(yīng)組分進(jìn)行了一定范圍的濃度變化;4)MgSO4(0.1 mol∕L)1—3 μL;5)Betaine(5 μmol∕μL)2—8 μL;6)dNTPs(2.5 mmol∕μL)2—8 μL;7)引物 F3(10 μmol∕L)0.2—1 μL;引物 B3(10 μmol∕L)0.2—1 μL;引物 FIP(10 μmol∕L)1—3 μL;引物 BIP(10 μmol∕L)1—3 μL,用純水調(diào)整體積至 25 μL∕管,反應(yīng)溫度按 58 ℃、60℃、62℃、64℃作遞增比較,反應(yīng)時間選擇1 h、1.5 h、2 h進(jìn)行比較。LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳后,檢測有無梯狀多條產(chǎn)物帶,最終確定最佳的反應(yīng)條件。

1.6 PCV2 LAMP產(chǎn)物的酶切驗證

取LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物10 μL,根據(jù)BpiI(BbsI)內(nèi)切酶說明書,建立30 μL酶切體系,37℃酶切過夜,取10 μL酶切后的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳后檢測結(jié)果。

1.7 PCV2 LAMP特異性試驗

將豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)全長陽性質(zhì)粒DNA、豬偽狂犬病毒株(PrV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒株(PRRSV)、豬瘟病毒毒株(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)的DNA一起進(jìn)行相同條件下的LAMP擴(kuò)增,檢測所建立的LAMP方法的特異性。

1.8 PCV2 LAMP敏感性試驗

將豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)全長陽性質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,將LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳,檢測LAMP方法的敏感性。

1.9 PCV2 LAMP檢測方法的初步應(yīng)用

對上海和江蘇海門2個豬場采集的疑似PCV2的36份血樣提取DNA后,用建立的LAMP方法進(jìn)行檢測,統(tǒng)計陽性結(jié)果,并與PCR方法比較兩者的符合度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2 LAMP檢測方法的建立

優(yōu)化后的反應(yīng)體系為Bst DNA聚合酶(8 U∕μL)1.25 μL、 Bst緩沖液 2.5 μL、PCV2 DNA 模版1 μL(0.1 μg∕μL)、MgSO4(0.1 mol∕L)3 μL、Betaine(5 μmol∕μL)5 μL、dNTPs(2.5 mmol∕μL)3 μL、引物 F3(10 μmol∕L)0.4 μL、引物 B3(10 μmol∕L)0.4 μL、引物 FIP(10 μmol∕L)2.5 μL、引物 BIP(10 μmol∕L)2.5 μL,用純水調(diào)整體積至25 μL∕管。最佳反應(yīng)溫度和時間分別為62℃和1.5 h。

此次建立的PCV2 LAMP擴(kuò)增方法能夠檢測到PCV2全長質(zhì)粒DNA以及PCV2陽性組織樣本中提取的DNA,且空白對照符合預(yù)期(圖1)。對LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行BpiI(BbsI)酶切驗證,得到預(yù)期的196 bp和97 bp 2個條帶,表明建立的PCV2 LAMP擴(kuò)增的產(chǎn)物是符合引物設(shè)計預(yù)期的(圖2)。特異性試驗表明:從各種檢測的豬病原體DNA或RNA中只能擴(kuò)增到PCV2的陽性LAMP梯度條帶,其他病原體核酸檢測均為陰性,表明建立的PCV2 LAMP檢測方法具有較好的特異性(圖3)。通過敏感性試驗,將PCV2全長質(zhì)粒DNA模板10倍稀釋(1—1×10-6ng)后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,顯示建立的PCR方法最低能夠檢測到1×10-3ng(1 pg)的PCV2 DNA(圖4)。

圖1 LAMP方法檢測PCV2病毒DNAFig.1 Detection of PCV2 DNA by LAMP

圖2 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切驗證Fig.2 Verification of LAMP amplification products by enzyme digestion

圖3 PCV2 LAMP方法特異性比較Fig.3 Comparison of the specificity of PCV2 LAMP

圖4 PCV2 LAMP敏感性試驗Fig.4 Sensitivity tests of PCV2 LAMP method

2.2 PCV2 LAMP檢測方法的可視化結(jié)果判定及臨床檢測的初步應(yīng)用

2.2.1 PCV2 LAMP檢測方法的可視化結(jié)果判定

由于LAMP擴(kuò)增合成時,從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子會與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng),產(chǎn)生大量白色的焦磷酸鎂(Mg2P2O7)沉淀,因此可以通過肉眼觀測反應(yīng)后試管內(nèi)液體的渾濁度作為判定陽性與否的指標(biāo)。本研究建立的方法可以通過肉眼觀察反應(yīng)后的PCR管內(nèi)液體的渾濁度來區(qū)分陽性結(jié)果(圖5)。

2.2.2 PCV2 LAMP檢測方法的初步應(yīng)用

對上海和江蘇海門2個豬場采集的疑似PCV2的36份血樣進(jìn)行檢測,結(jié)果表明:陽性樣本數(shù)為19份,陽性率為52.8%。將這19份LAMP陽性樣本通過本研究室前期建立的PCV2的PCR診斷方法[7]進(jìn)行驗證,其中18份檢測顯示PCR陽性,兩者的陽性符合率為94.7%,表明LAMP檢測方法具有較高的靈敏度,對于生產(chǎn)基地的臨床檢測具有較好的適用性,同時也表明目前PCV2感染在上海及周邊地區(qū)的豬場中廣泛存在。

圖5 PCV2 LAMP可視化結(jié)果Fig.5 Visualization results of PCV2 LAMP

3 討論

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染僅通過癥狀很難做出準(zhǔn)確的臨床診斷,而且該病原往往與其他豬病原體混合感染,導(dǎo)致感染豬出現(xiàn)多種病理性的臨床癥狀。

目前,對于該病原體最主要的實驗室診斷技術(shù)是PCR和ELISA方法[8]。前者根據(jù)PCV2的基因序列設(shè)計引物,并通過PCR方法擴(kuò)增到目標(biāo)基因片段,并可通過電泳、酶切或測序等方法來驗證試驗結(jié)果。本實驗室早期曾建立了PCV2的PCR診斷方法,該方法準(zhǔn)確、快速,但主要局限是需要有PCR儀、電泳儀器、紫外凝膠成像系統(tǒng)等設(shè)備才能進(jìn)行診斷操作,并不適合基層臨床進(jìn)行快速診斷。而ELISA方法主要是通過檢測豬血清中的PCV2抗體水平,來診斷是否有PCV2的感染。雖然ELISA方法較為適合豬群的PCV2抗體水平監(jiān)測,但ELISA方法屬于血清學(xué)檢測,結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)較難劃定,容易出現(xiàn)一些假陽性。LAMP方法的優(yōu)點(diǎn)是可以不需要復(fù)雜精密的儀器,只需要在水浴鍋或保溫杯中就可完成試驗的操作。LAMP方法較PCR方法有更高的靈敏度,而且方便的可視化結(jié)果判定更適合基層單位的臨床使用。

在本研究過程中,注意到LAMP方法中體系內(nèi)的內(nèi)外引物的比例以及Mg2+濃度的優(yōu)化比較重要,對于不同的LAMP引物需要對反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度進(jìn)行不同的優(yōu)化以達(dá)到最佳的反應(yīng)條件。同時,本研究也發(fā)現(xiàn),由于LAMP方法的高靈敏度,也容易出現(xiàn)一定的假陽性,特別是在操作過程中容易發(fā)生氣溶膠污染,尤其是移液器、槍頭容易交叉污染,所以在進(jìn)行LAMP過程中,如發(fā)現(xiàn)污染,要對實驗臺、移液器、PCR管等耗材進(jìn)行徹底消毒或高壓處理后方可重新進(jìn)行試驗。

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