清熱解毒扶正顆粒對內毒素大鼠肺腎組織NF—κBp65蛋白的影響

萬啟南++韋袞政 李黔云++祁燕++童曉云++陳維??

摘要：目的探討清熱解毒扶正顆粒對內毒素大鼠肺腎組織NF-κBp65蛋白的影響。方法72只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、甲強龍組以及中藥低、中、高劑量組，采用腹腔注射脂多糖法建立大鼠內毒素血癥模型。正常組對照組、模型對照組予生理鹽水1 mL/100 g灌胃，每天1次；甲強龍組給甲基強的松龍117 mg/100 g灌胃，每天1次；中藥組給清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量1 mL/100 g灌胃，每天1次；實驗結束后，采用Western blotting法檢測大鼠肺、腎組織NF-κBp65蛋白的表達。結果模型對照組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常對照組，中藥高劑量組與甲強龍組較好地降低內毒素大鼠肺、腎組織NF-κBp65蛋白水平，兩組之間比較無統計學差異，中藥低劑量組和中劑量組降低NF-κBp65蛋白水平的效果較差，與高劑量組和甲強龍組相比有統計學差異。結論清熱解毒扶正顆粒能有抑制內毒素大鼠肺腎組織NF-κBp65蛋白表達的效果，降低內毒素血癥的炎癥反應，對內毒素有一定的治療作用。

關鍵詞：清熱解毒扶正顆粒；內毒素血癥；NF-κB p65蛋白

中圖分類號：R2855文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）05-0016-05

[WT5HZ][JZ]Effects of Qingre Jiedu Fuzheng Granule on NF-κBp65 Protein in Lung-Kidney[JZ]Tissue of Endotoxin Rats

[WT5BZ][JZ]WAN Qi-nan， WEI Gen-heng， LI Qian-yun， QI Yan， TONG Xiao-yun， CHEN Wei

[WT5"BX][JZ]（Yunnan Hospital， Kunming of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021， Yinnan）

[WT5HZ]【Abstract】[WTBZ]Objective： To study the effect of Qingre Jiedu Fuzheng Granule on NF-κBp65 protein in lung-kidney tissue of endotoxin rats. Methods： 72 rats were randomly divided into a normal control group， a model control group， a methylprednisolone group and low， medium and high dose groups of traditional Chinese medicine. Rat endotoxemia models were established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide method. The normal group and the model control group were given intragastric administration of 1 mL/100g of normal saline once daily. The methylprednisolone group was administrated 1.17 mg/100g of methylprednisolone once daily. The low， medium and high dose groups were administrated 1 mL/100 g of Qingre Jiedu Fuzheng Granule once daily. After the experiments were finished， the expression of NF-κBp65 protein in lung and kidney tissue of the rats was detected by Western blotting. Results： The level of NF-κBp65 protein in the model control group was significantly higher than that in the normal control group. The NF-κBp65 protein level in the lung and kidney of endotoxin rats of the high dose group and the methylprednisolone group decreased and there was no statistic difference between the two groups. The level of NF-κBp65 protein in the low dose group and the middle dose group decreased poorly， but compared with that of the high dose group and the methylprednisolone group， there was statistical difference. Conclusion： Qingre Jiedu Fuzheng Granule can inhibit the expression of NF-κBp65 protein in the lung and kidney of endotoxin rats， reduce the inflammatory reaction of endotoxemia and has certain curative effect on endotoxin.

[WTHZ]【Key words】[WTBZ]Qingrejiedu Fuzheng Granule， endotoxemia， NF-κB p65 protein

內毒素血癥（ETM）是指循環血中出現可檢出的內毒素的病癥。內毒素血癥發生原因主要是在嚴重創傷、感染等應激狀態下全身的網狀內皮系統功能障礙，免疫機能下降，誘導內毒素血癥及全身免疫反應的發生，導致機體組織、細胞的損傷[1][2]。內毒素血癥誘導的大量炎性介質失控性釋放所致的全身炎性反應綜合征（SIRS），以及進一步惡化發展成為的多臟器功能失常綜合征（MODS）是嚴重感染患者走向死亡的主要途徑，而該惡性進展的關鍵啟動因子為內毒素及其誘導的失控性釋放的大量炎性介質。脂多糖（LPS）是常用的誘導內毒素血癥的毒素。在脂多糖誘導的炎癥反應信號傳導通路中，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路的激活與多種致炎介質釋放密切相關[3]。NF-κB位于TLR下游信號通路的樞紐位置，它是一種普遍存在的轉錄因子，主要由P65和P50兩個亞基組成，在常態下，NF-κB存在于細胞的胞質內，與其抑制因子IκB結合。作為多種信號轉導途徑的匯聚點，不僅參與介導了免疫應答、病毒復制、細胞凋亡和增殖的多種基因的表達調控，而且在調節炎癥反應的基因中起關鍵作用[4-5]。當細胞受到內毒素、腫瘤壞死因子，白細胞介素等炎性分子刺激后，將信號轉導入細胞內，最終引起NF-κB的活化，并誘導TNF-α、IL-1β、誘導型一氧化氮合酶（induced NO synthase，iNO）、趨化因子如IL-8、巨噬細胞趨化因子（MDF）及趨化因子受體等多種炎性分子的轉錄、表達，反饋激活NF-κB，加劇了組織的損傷[6-7]。

內毒素血癥與中醫學“熱毒”、“溫病”、“瘟疫”等病癥相類似，中醫藥對此類病癥有一定的療效，名老中醫臨床經驗方清熱解毒扶正顆粒具有清熱解毒、涼血化瘀、益氣養陰的功效，對此類病癥有一定的效果。研究表明，清熱解毒扶正顆粒有明顯抑制炎性腫脹作用；明顯降低內毒素所致家兔的高熱；降低內毒素致高熱家兔的C-反應蛋白水平。臨床研究表明，清熱解毒扶正顆粒能明顯降低老年肺炎患者升高的體液免疫指標；降低升高的血白細胞、血清降鈣素原、C反應蛋白水平，有顯著的抗感染作用。能降低慢性阻塞性肺疾病患者的二氧化碳分壓，提高其氧分壓，對外感高熱、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等具有較好的療效[8-12]。現從TLR信號通路研究清熱解毒扶正顆粒對NF-κB p65的影響，探討如下。

1材料和方法

11材料

111實驗動物選擇合格清潔型Wistar大鼠（合格證號：SCXK{川}2013-24，001643）72只，體重（200±20）g。

112主要實驗儀器及試劑脂多糖（LPS，Sigma公司，批號：L2630），兔抗大鼠NF-κBp65抗體（sigma公司，批號L2630），數碼凝膠圖象處理系統（GIS-2009型號）；超低溫冰箱（海爾立式BD370LT-86L-1型號）；離心機（10R，美國Thermo公司）；紫外分光光度計（UV-2450PC型號）；恒溫箱（3111，美國Thermo公司）。

113實驗藥品清熱解毒扶正顆粒：由翼首草，荷葉頂，魚腥草，柴胡，葛根，太子參，麥冬，丹皮，薏苡仁等十四味藥組成。由云南中醫學院第一附屬醫院中藥房鑒定中藥制劑室制備。1 g相當于原生藥126 g。低劑量組含生藥為05 g/ml，中劑量組含生藥為1 g/ml，高劑量組含生藥為2 g/ml，甲基強的松龍（國藥集團容生制藥有限公司，40 mg，國藥準字H20030727）。

12方法

[KG（0.15mm]121模型制備72只大鼠進行編號，依隨機數字表法分為中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、正常組、模型對照組、西藥組。除正常組外，其余大鼠根據文獻[1]采用腹腔注射脂多糖致大鼠內毒素血癥模型。具體操作方法是先每日測量大鼠體溫（肛溫）2次，連續2日，取2次體溫的平均值記為基礎體溫。單次體溫超過38℃或2次體溫差超過05℃的大鼠剔除。實驗前6 h禁食不禁水。然后腹腔注射LPS，誘導動物發熱，注射LPS后每隔05 h測1次體溫，連續測8 h。體溫低于38℃的大鼠剔除。[KG）]

122藥物治療①正常組予生理鹽水1 mL/100 g體重灌胃，每天1次；②模型對照組予生理鹽水1 mL/100 g體重灌胃，每天1次；③西藥組給甲基強的松龍117 mg/100 g體重灌胃，每天1次；④中藥低、中、高劑量組分別給予清熱解毒扶正顆粒低、中、高劑量1 mL/100 g體重灌胃，每天1次；各組連續灌胃28 d。

123實驗標本處理4周后（28 d）麻醉大鼠，解剖打開大鼠腹腔，腹主動脈穿刺放血至大鼠死亡，剝離左腎臟外膜，切取左腎，解剖打開胸腔，分離肺組織器官，切取左上肺葉。腎、肺標本置無菌試管中-20℃保存在。

13Western blotting檢測分別取各組肺、腎組織，用冷PBS液沖洗，在添加有蛋白酶抑制劑裂解液中勻漿，將勻漿液轉至無菌聚丙烯離心管中，經超聲震蕩，離心提取總蛋白，分光光度計測定其濃度。分別取各樣本總蛋白50 ug用聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后電轉移法至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室溫下將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉1h，然后加人兔抗大鼠NF-κBp65及內參對照GAPDH的抗體，4℃過夜。室溫下TBST漂洗PVDF膜，加人用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗在室溫下孵育1h。TBST再次漂洗PVDF膜，ECL試劑盒化學熒光法覆蓋條帶，全自動曝光機曝光，數碼凝膠圖象處理系統測定目的條帶的光密度值，進行定量分析，嚴格按照試劑說明書操作。

14統計學方法計量資料均以均值±標準差（x[TX-*3/8]±s）表示，采用One-K-S檢驗進行方差齊性檢驗；樣本方差齊性時，采用單因素方差分析進行組間比較；方差不齊者采用兩個獨立樣本檢驗，數據使用SPSS190統計軟件進行處理，以P<005為差異有統計學意義。

2結果

通過動物實驗，結果顯示，在肺、腎組織中，低劑量組與中劑量組比較，2組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；低劑量組與高劑量組比較，高劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著低于低劑量組（P<005）；高劑量組更好地降低NF-κBp65蛋白水平；低劑量組與甲強龍組比較；甲強龍組NF-κBp65蛋白水平顯著低于低劑量組（P<001），甲強龍組較好地降低NF-κBp65蛋白水平；低劑量組與正常組比較，低劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常組（P<001）；低劑量組與模型組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；中劑量組與高劑量組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平明顯高于高劑量組（P<005），中劑量組降低NF-κBp65蛋白水平明顯低于高劑量組；中劑量組與甲強龍組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著高于甲強龍組NF-κBp65蛋白水平（P<005）；中劑量與正常組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常組（P<005）；中劑量與模型組比較，中劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著低于模型組（P<005）。高劑量組與甲強龍組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005），降低NF-κBp65蛋白水平效果相當；高劑量組與正常組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；高劑量組與模型組比較，高劑量組NF-κBp65蛋白水平顯著低于模型組（P<001），高劑量組降低NF-κBp65蛋白水平的效果顯著；甲強龍組與正常組比較，兩組NF-κBp65蛋白水平無顯著性差異（P>005）；甲強龍組與模型組比較，甲強龍組NF-κBp65蛋白水平顯著低于模型組（P<001）；正常組與模型組比較；模型組NF-κBp65蛋白水平顯著高于正常組（P<001），造模后，NF-κBp65蛋白水平顯著升高。肺、腎組織NF-κBp65灰度值見表1，肺組織NF-κBp65蛋白表達見圖1，腎組織NF-κBp65蛋白表達見圖2。

3討論

在內毒素炎癥反應中，LPS激活TLR4通路目前主要有兩條公認的信號途徑[13]：一條是髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴的信號通路；另一條是MyD88非依賴的信號通路。IL-1R受到IL-1刺激后，啟動信號途徑招募的第一個銜接分子就是MyD88[14]。MyD88激酶作為IL-1R的銜接蛋白，募集下游的蛋白激酶IRAK，導致IRAK自身磷酸化；磷酸化IRAK與TRAF6結合，TRAF6活化引起兩條不同的信號轉導通路，一條包括P38MAPK和JNK通路在內的MAPK信號通路，另一條是NF-κB通路，NF-κB作為一種普遍存在的轉錄因子，經激活后，轉入細胞核中誘導特定基因的表達，并激活細胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等促炎細胞因子的表達，從而產生大量的致炎因子如TNF-α、NO、COX-2等，引起組織炎癥反應性損傷。TLR4/NF-κB通路是啟動細胞內炎癥信號傳導的經典通路，NF-κB是細胞內生物信號傳導中關鍵性炎癥因子。阻斷內毒素炎性反應信號通路的關鍵環節，抑制炎性因子的釋放，促進炎性因子的阻斷將對內毒素炎性反應有重要的治療作用。

[KG（0.15mm]中醫藥治療內毒素血癥既有直接的拮抗內毒素作用，更有其顯著的增強機體免疫對內毒素的解毒功效[15]。本研究從TLR4信號通路中針對NF-κBp65炎癥反應信號環節進行探討，結果顯示，脂多糖腹腔注射后，大鼠的肺腎組織NF-κBp65蛋白水平比正常組顯著增高，清熱解毒扶正顆粒低劑量組、中劑量組降低NF-κBp65蛋白水平較較弱，而高劑量組有效降低內毒素大鼠NF-κBp65蛋白水平，其效果與甲強龍相當，比低劑量組、中劑量組顯著增強，存在量效關系。清熱解毒扶正顆粒能夠抑制炎癥反應引起的NF-κBp65激活、轉錄，從而降低由于NF-κBp65激活導致的下游多種炎性因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-а、NO、COX-2、MDF等炎性介質激活、釋放，進而降低炎癥反應，減輕組織炎性損傷。復方中藥療效是多成分的效應，可多途徑、多環節、多靶點地發揮作用。清熱解毒扶正顆粒對內毒素血癥的療效途徑包含了NF-κBp65信號通路，其效果與甲強龍相似，提示清熱解毒扶正顆粒與甲強龍有類似的信號通路作用機制，至于其如何對NF-κBp65產生抑制作用，有待進一步研究。[KG）]

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