水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑的設計、合成及活性研究

傅榕賡，楊辰枝子，嚴建業，翁 臻，周 鑫，李林和，熊廣華，廖端芳*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學人文社科學院，湖南 長沙 410208；3.國家重點學科國家中醫藥管理局病理生理實驗室，湖南 長沙 410208）

水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑的設計、合成及活性研究

傅榕賡1，楊辰枝子2，嚴建業1，翁 臻1，周 鑫1，李林和1，熊廣華3，廖端芳1*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學人文社科學院，湖南 長沙 410208；3.國家重點學科國家中醫藥管理局病理生理實驗室，湖南 長沙 410208）

目的 利用骨架躍遷思想設計并合成新型水楊酰苯胺類代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5,mglu5)拮抗劑。方法 將取代水楊酸與二取代苯胺縮合得目標化合物I-IV，用核磁共振和質譜進行結構確證，熒光測鈣流法進行拮抗mglu5活性測定。結果 設計的目標化合物對mglu5具有明顯的拮抗活性，其中化合物I拮抗活性最好，IC50為0.079 μmol/L。結論 水楊酰苯胺類化合物為潛在的新型mglu5拮抗劑，值得進一步研究。

水楊酰苯胺；代謝型谷氨酸受體5拮抗劑；骨架躍遷

代謝型谷氨酸受體 5(metabotropic glutamate receptor5,mglu5)屬于G蛋白偶聯受體家族的成員，在中樞神經系統廣泛存在，在神經系統的發育、突出功能發揮、神經系統疾病如Alzheimer’s disease等方面均發揮了至關重要的作用[1]。近年來的研究發現，mglu5不僅存在于腦組織，在許多外周器官和組織中也有表達，mglu5其表達及活性的異常還與惡性腫瘤（如肝癌）的發生發展關系密切[2]。因此，mglu5已成為相關疾病新藥研究的熱門靶點。

1 水楊酰苯胺類mglu5 拮抗劑的設計

目前 mglu5拮抗劑代表骨架主要有二芳基類直線型分子，如圖1所示，二芳基乙烯 （SIB-1893）、二芳基乙炔（MPEP）以及二芳基偶氮化合物（SIB-1757）[3-4]。其中MPEP為目前最常用的工具藥之一。除了直線型骨架外，近年來還報道了一類以4-苯胺基喹唑啉為骨架的 mglu5拮抗劑如化合物1[5]。

圖1 代表性mglu5受體拮抗劑

基于骨架躍遷的藥物設計是近年來迅速發展的尋找新結構先導化合物的有效方法。為了尋找新型mglu5拮抗劑，本課題組發現水楊酰苯胺類化合物結構中的2位羥基與酰胺羰基通過分子內氫鍵形成一個六元環構型，該構型與母核為4-苯胺基喹唑啉的mglu5拮抗劑空間構型具有相似性 (如圖2所示)。此外，水楊酰苯胺結構與SIB-1757結構中兩個疏水芳環在化學空間上具有一定的重疊，水楊酰苯胺中的羥基與SIB-1757結構中的羥基能都重疊。因此，本文將水楊酰苯胺這一分子骨架與4-苯胺基喹唑啉分子骨架進行骨架躍遷，考慮到水楊酰苯胺的分子柔性度較4-苯胺基喹唑啉高，采用二取代的苯胺作為取代基，以期望提高mglu5的結合，設計并合成了4個水楊酰苯胺類新型的mglu5拮抗劑。以MPEP為陽性對照，采用熒光測鈣流法篩選化合物對mglu5的體外拮抗活性。

圖2 水楊酰苯胺mglu5拮抗劑的設計

如圖3所示，4個目標化合物均以5-氯水楊酸或5-溴水楊酸為原料，經酚羥基乙?；笈c二取代苯胺縮合制備目標化合物。

圖3 目標化合物的合成路線

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

X-4數字顯示微熔點測定儀 （上海精科儀器有限公司）；Varian inova-400型核磁共振譜儀 （美國Varian公司）；TMS為內標，DMSO-d6為溶劑；Agilent 1946B ESI-MS型質譜儀（美國Agilent公司）5-氯水楊酸、5-溴水楊酸、2-氯-4-三氟甲基苯胺、2-氯-4-氰基苯胺、3,5-二氯苯胺、3-氯-5-三氟甲基苯胺為化學純，購自元素商城；其他試劑均為分析純。

2.2 化合物的合成步驟

2.2.1 5-溴乙酰水楊酸的合成 將2 g 5-溴水楊酸、7 mL Ac2O、3滴吡啶加入100 mL圓底燒瓶，升溫攪拌至回流，回流反應1 h，將反應液緩慢傾倒至冰水中，攪拌2 h，抽濾，干燥得白色固體（2.4 g，收率100%）即為5-溴乙酰水楊酸。無需純化即可投入下一步反應。

2.2.2 5-氯乙酰水楊酸的合成 參照“2.2.1”方法制備，得白色粉末固體5-氯乙酰水楊酸。無需純化即可投入下一步反應。

2.2.3 目標化合物I的合成 將0.5 g 5-氯乙酰水楊酸和5 mL氯化亞砜滴加入圓底燒瓶，升溫至80℃，攪拌反應2 h。將所得溶液濃縮至干，濃縮液溶于5 mL二氯甲烷，冰浴下緩慢滴加入含有吡啶、3,5-二氯苯胺的二氯甲烷溶液，攪拌反應1 h。TLC確定反應終點，反應液濃縮后溶于THF，并加入NaOH調至pH為10，攪拌10 min，后將溶液調至pH為 7抽濾得固體即為目標化合物 I。收率：15%，mp：245～246℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ：11.44(s,1H,OH),10.56(s,1H,NH), 7.83(d,J=2.4 Hz,3H,Ar-H),7.47(dd,J=2.4,2.4 Hz,1H,Ar-H),7.36 (s,1H,Ar-H),7.03 (d,J= 8.8,1H,Ar-H)。ESI-MS(m/z):314.9610(M-H)-。

2.2.4 目標化合物II的合成 將5-氯乙酰水楊酸和3-氯-5-三氟甲基苯胺作為反應物。制備方法同“2.2.3”，得白色固體，收率：17%，mp：203～205℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:11.41 (s,1H, OH),10.71 (s,1H,NH),8.13 (d,J=7.2 Hz,2H, Ar-H),7.84(d,J=2.4 Hz,1H,Ar-H),7.61(s,1H, Ar-H),7.48 (dd,J=2.8,2.4 Hz,1H,Ar-H),7.03 (d,J=8.6 Hz,1H,Ar-H)。ESI-MS (m/z):348.986 0(M-H)-。

2.2.5 目標化合物III的合成 將5-溴乙酰水楊酸和2-氯-4-三氟甲基苯胺作為反應物。制備方法同“2.2.3”，得白色固體，收率：23%，mp：201～203℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:11.47 (s,1H, NH),8.59(s,1H,OH),8.59(s,1H,Ar-H),7.74 (d,J=2.4 Hz,1H,Ar-H),7.65(d,J=2.4 Hz,1H, Ar-H),7.62 (dd,J=8.2,2.4 Hz,1H,Ar-H),7.59 (dd,J=8.6,2.4 Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J=4.0 Hz, 1H,Ar-H)。ESI-MS(m/z):392.9451(M-H)-。

2.2.6 目標化合物IV的合成 將5-氯乙酰水楊酸和 2-氯-4-氰基苯胺作為反應物。制備方法同“2.2.3”，得白色固體，收率：25%，mp：263～265℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:12.45 (s,1H, OH),11.25 (s,1H,NH),8.71 (d,J=8.8 Hz,1H, Ar-H),8.19(d,J=1.6 Hz,1H,Ar-H),7.96(d,J= 2.8 Hz,1H,Ar-H),7.88 (dd,J=1.6,1.6Hz,1H, Ar-H),7.53 (dd,J=2.8,2.8 Hz,1H,Ar-H)，7.09（d，J=8.8 Hz,1H,Ar-H）。ESI-MS(m/z):306.992 1(M-H)-。

2.3 目標化合物I-IV的mglu5拮抗活性測定[6]

檢測拮抗劑活性時，將激動劑L-Glu和拮抗劑分別配制成10×測試濃度，并將其等體積混合成5×測試濃度，以25 μL/s的速度將25 μL的化合物加入到表達mglu5的HEK-293細胞中，在加入化合物16 s之后，采集熒光染料Fluo-3/AM標記的鈣流變化數據直至120 s。

化合物的IC50值使用軟件GraphPad Prism 5進行非線性曲線擬合計算得到。

3 結果與討論

目標化合物經核磁共振和質譜進行結構確證。目標化合物I-IV對mglu5具不同程度的mglu5拮抗活性，IC50值分別為0.079、0.23、0.19和11.5 μmol/L。陽性對照化合物MPEP的IC50值為0.015 μmol/L。結果如圖4所示：化合物I的活性最強，化合物II與III活性相當，化合物IV活性最弱?；衔颕、II、III活性達到nM級。初步構效關系為：（1）3,5二取代苯胺的活性強于2,4-二取代苯胺；（2）雙鹵素取代苯胺活性強于鹵素與三氟甲基取代的苯胺，如化合物I與II。出現上述活性差異的原因推測與取代基和mglu5結合口袋的空間相互作用有關。從活性結果看，水楊酰苯胺類化合物是潛在的mglu5拮抗劑。本研究利用骨架躍遷這一新藥設計思想，設計了四個水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑，首次報道了四個化合物對mglu5的拮抗活性，為發現新型mglu5拮抗劑提供新的研究方向。

圖4 化合物I-IV對mglu5的拮抗活性

[1]Wijetunge LS,Till SM,Gillingwater TH,et al.mGluR5 regulates glutamate-dependent development of the mouse somatosensory cortex[J].J Neurosci,2008,28(49):13028-13037.

[2]Wu YL,WangNN,Gu L,etal.Thesuppressiveeffect of metabotropic glutamate receptor 5(mGlu5)inhibition on hepa tocarcinogenesis[J].Biochimie,2012,94(11):2366-2375.

[3]Varney MA,Cosford ND,Jachec C,et al.SIB-1757 and SIB-1893:selective,noncompetitive antagonists ofmetabotropic glutamate receptor type 5[J].J Pharmacol Exp Ther,1999,290(1): 170-181.

[4]Cosford ND,Tehrani L,Roppe J,et al.3-[(2-Methyl-1,3-thiazol-4-yl)ethynyl]-pyridine:a potentand highly selec tive metabotropic glutamate subtype 5 receptor antagonist with anxiolytic activity[J].J Med Chem,2003,46(2):204-206.

[5]Felts AS,Saleh SA,Le U,et al.Discovery and SAR of 6-substituted-4-anilinoquinazolinesasnon-competitiveantagonistsof mGlu5 [J].Bioorg Med Chem Lett,2009,19(23):6623-6626.

[6]石 榴,蔣亞琴,白艷秋.代謝型谷氨酸受體5亞型高通量篩選模型的建立[J].中國生物工程雜志,2010,30(5):81-86.

（本文編輯 蘇 維）

Design,Synthesis,and Activity Screening of New Potent Mglu5 Receptor Antagonists Based on the Salicylanilide Structure

FU Ronggeng1,YANG Chenzhizi2,YAN Jianye1,WENG Zhen1,ZHOU Xin1,LI Linhe1, XIONG Guanghua3,LIAO Duanfang1*
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.School of Humanities, Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;3.Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To design,synthesis and activity screening of salicylanilides as new mglu5 receptor antagonist. Methods A scaffold hopping approach has been exploited to design a novel class of mglu5 receptor antagonists I-IV. The design compounds were synthesized by using salicylic acids and anilines.The structures of target compounds were identified by NMR and MS.The activity of mglu 5 was screened by Ca2+mobilization assay.Results The designed salicylanilides show potent antagonistic activity to mglu5 receptor in vitro.Among them,compound I was the best,and IC50of compound I was 0.079 μmol/L.Conclusion The salicylanilides were new potent mglu5 receptor antagonist and worth to be further studied.

salicylanilide;mglu5 receptor antagonist;scaffold hopping

R284.3；R914.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.007

2016-09-23

湖南省自然科學基金項目（2015JJ6085）；湖南省教育廳資助科研項目（13B080）；2015藥學湖南省重點學科開放基金項目；2015中醫藥國際合作專項基金資助項目（ZYGZ201502）；湖南中醫藥大學本科教學質量工程項目（ZY-005）。

傅榕賡，男，博士，講師，研究方向：藥物化學研究。

*廖端芳，男，教授，博士研究生導師，E-mail：dfliao@hnctcm.edu.cn。

本文引用：傅榕賡，楊辰枝子，嚴建業，翁 臻，周 鑫，李林和，熊廣華，廖端芳.水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑的設計、合成及活性研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017,37(5):489-492.