活血降糖飲對長期高脂飼料喂養大鼠胰島β細胞凋亡的影響?

楚淑芳,李惠林,劉德亮,趙恒俠

( 廣州中醫藥大學深圳臨床醫學院，深圳市中醫院，廣東 深圳 518033)

【實驗研究】

活血降糖飲對長期高脂飼料喂養大鼠胰島β細胞凋亡的影響?

楚淑芳,李惠林△,劉德亮,趙恒俠

( 廣州中醫藥大學深圳臨床醫學院，深圳市中醫院，廣東 深圳 518033)

目的: 研究活血降糖飲對長期高脂飼料喂養大鼠胰島β細胞凋亡的影響及其分子機制。方法: 采用長期(28周) 高脂喂養建立胰島素抵抗、高脂血癥大鼠模型，按隨機數字表法分為模型組、中藥組、貝特組，另設正常對照組。藥物干預治療后行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)及胰島素釋放試驗(IRT)，并測定各組大鼠生化指標及凋亡相關蛋白表達、胰腺組織病理學及脂肪含量。結果: 與模型組比較，中藥組大鼠 OGTT、IRT明顯改善，甘油三酯( TG)、血清總膽固醇( TC)、低密度脂蛋白膽固醇( LDL-C)、游離脂肪酸( FFA) 明顯降低，而高密度脂蛋白膽固醇( HDL-C)明顯升高。與正常組比較，模型組大鼠胰腺TG含量明顯升高，胰腺可見明顯脂肪沉積，胰島β細胞凋亡明顯增加；與模型組比較，中藥組和貝特組胰腺脂肪含量明顯減少，胰腺脂肪沉積明顯改善，胰島β細胞凋亡明顯減少。相關性分析表明，胰島β細胞凋亡指數與胰腺TG含量呈正相關。與正常組比較，模型組大鼠胰腺Bcl-2蛋白表達明顯下調，Bax蛋白表達明顯上調，而中藥組和貝特組大鼠胰腺Bcl-2蛋白表達明顯上調，Bax蛋白表達明顯下調。結論: 活血降糖飲防治脂毒性所致大鼠胰島細胞凋亡的作用可能與調節胰腺Bcl-2和Bax蛋白表達有關。

活血降糖飲；高脂血癥；胰島素抵抗；β細胞凋亡

臨床研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者常在診斷前數年至數十年就有脂代謝紊亂，進而血液中游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平升高，長期暴露于高濃度FFA下，脂肪異位沉積，致胰島β細胞功能受損，誘導其凋亡和壞死，進而胰島素分泌減少、糖異生增加，其中以誘導β細胞凋亡為主[1]。因此，抑制胰腺脂肪沉積，預防β細胞脂毒性凋亡可能成為防治T2DM的新靶點。活血降糖飲具有益氣養陰、活血通絡的作用，由黃芪、生地、丹參等12味中藥組成。前期研究證實，其有良好的調脂降糖作用及可能的作用機制[2]。本研究主要研究其對胰腺脂肪沉積、胰島β細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及飼養

SPF級健康雄性2月齡SD大鼠40只，體質量150～180 g，購于廣東省實驗動物中心。動物飼養于SPF級動物實驗中心，溫度20℃、濕度60%左右，每日光照時間12 h，自由攝食、飲水，飼料由南方醫科大學實驗動物中心提供。常規飼料成分為碳水化合物64%，蛋白質23%，脂肪13%；高脂飼料熱量組成為碳水化合物20%，蛋白質20%，脂肪60%。

活血降糖飲組方：黃芪30 g，生地20 g，太子參30 g，桃仁10 g，紅花12 g，丹參30 g，五味子15 g，麥冬15 g，山藥12 g，黃精15 g，丹皮12 g，大黃16 g。上藥煎煮、過濾并制成濃度為4 g/mL濃縮液。非諾貝特膠囊(法國利博福尼制藥公司生產)制成濃度為2 g/L的混懸液，溶劑為雙蒸水。

1.3 試劑與儀器

TUNEL試劑盒購于羅氏公司，胰島素、B淋巴細胞瘤-2(B-cell Lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)、兔抗大鼠抗體購于CST公司，山羊抗兔Dylight-800熒光二抗購自KPL公司。檢測儀器有電泳槽(DYCZ-24型)、酶標儀(北京六一儀器廠)、德國蔡司LSM710激光共聚焦顯微鏡、JEM-1200EX型透射電鏡(日本)、Quantity One定量分析軟件及HMIAS-2000圖像分析系統。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物模型建立和分組 適應性喂養2周，隨機選出8只作為正常組普通飼料喂養。其余給予高脂飼料喂養28周后，根據血清TC、TG、FFA、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)水平篩選出24只成模大鼠，隨機分為模型組、中藥組、貝特組各8只。

1.4.2 動物處理 中藥組以5 g/kg/d的劑量灌服中藥煎劑，貝特組以20 mg/kg/d的劑量灌服非諾貝特混懸液，正常組和模型組以等體積雙蒸水灌胃，模型組、中藥組、貝特組均喂以高脂飼料。

1.4.3 標本制備 治療后行OGTT及IRT實驗。以10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清用于檢測生化指標等。取胰腺組織，以4%多聚甲醛固定，剩余胰腺組織儲存于液氮中。

周末，許元生照例沉浸在他的代碼世界里，如蕓也如法炮制，要逼他學做飯。他在廚房里叮叮當當了半天，才端出一碗黑乎乎的面條，還沒等她批評他，他卻紅了眼圈，“我只想安安靜靜地碼個代碼，不行嗎？”

1.4.4 指標測量 血清學指標按照試劑盒說明書檢測。 胰腺組織脂肪含量的測定： 100 mg胰腺加100 μL組織脂質勻漿緩沖液在4℃冰水浴勻漿后，取10 μL加入TritonX-100、三甲基甲醇10 μL和甲醇混合液(v/v=1/1)5 μL混勻，離心取上清，用酶法測定TG含量，并計算胰腺組織TG含量。Western blot測定胰腺組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達，提取總蛋白并測定蛋白濃度；取50 μg蛋白，采用10% SDS-PAGE 凝膠，轉膜、封閉2 h再用抗體稀釋液稀釋一抗，4℃過夜。第2天洗膜后用1∶5000的山羊抗大鼠二抗搖床孵育2 h，進行雜交ECL化學發光。用凝膠成像系統分析條帶的吸光度，用蛋白/內參表示蛋白的表達量。

1.4.5 病理學檢測 觀察胰腺的形態大小、顏色、質地，并取胰尾部固定、石蠟包塊、HE染色，在光鏡下觀察胰島及其細胞情況。

1.4．6 電子顯微鏡檢測胰島細胞凋亡情況 取新鮮胰腺組織1 mm3，經修塊清洗后放入2.5%戊二醛中前固定4 h，PBS清洗，放入1%鋨酸中后固定2 h，脫水、包埋放入烤箱中聚合72 h，超薄切片機上切片，經硝酸鉛和醋酸鈾雙重染色后，在JEM-1200EX型透射電鏡中觀察。

1.4.7 原位末端核苷酸標記法(TUNEL)檢測胰島β細胞凋亡 按TUNEL試劑盒說明書操作，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察。從每個胰腺中取6張雙染切片，每張切片中取10個視野計算凋亡指數。

2 結果

2.1 各組大鼠 OGTT水平比較

表1圖1顯示，模型組大鼠血清OGTT各點血糖水平較正常組均升高(P<0.01)；2治療組大鼠OGTT結果比模型組各個時間點的血糖水平均有明顯下降 (P<0.01)。

組 別鼠數血糖(mmol/L)0h0 5h1h2h3h正常組85 70±0 687 03±0 797 56±0 857 23±0 747 35±0 48模型組86 91±0 62??10 46±1 73??10 95±1 57??10 18±1 39??10 26±1 06??中藥組85 69±0 81▲▲7 53±1 60▲▲7 64±1 25▲▲7 90±0 77▲▲8 11±0 75▲▲貝特組85 67±0 50▲▲8 23±0 81▲8 68±0 76▲▲8 31±1 07▲▲9 00±1 21

注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

圖1 OGTT結果

圖2 IRT結果

2.2 各組大鼠IRT水平比較

表2圖2顯示，模型組大鼠血清IRT各點胰島素水平較正常組均升高(P<0．01)，2治療組比較模型組各點胰島素水平均有不同程度降低 (P<0.01)。

組 別鼠數0h0 5h1h2h3h正常組860 64±22 17147 79±24 44109 05±28 7384 09±14 5987 89±22 96模型組8119 97±34 87??161 47±29 92172 61±35 54??153 24±42 93??120 12±11 53??中藥組870 40±17 49▲▲106 10±20 20▲▲149 49±29 5391 05±22 24▲▲86 58±13 21▲▲貝特組872 80±20 63▲▲113 30±24 22▲▲136 06±29 84124 71±42 73▲▲79 07±13 97▲▲

注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.3 各組大鼠HOMA-IR、ISI水平及胰腺TG含量比較

表3顯示，模型組大鼠HOMA-IR、胰腺TG含量較正常組明顯升高(P<0.01)，而ISI水平明顯降低(P<0.01)；2治療組HOMA-IR、胰腺TG含量與模型組比較均明顯降低(P<0.01)，ISI水平明顯升高(P<0.05)。

2.4 各組大鼠血脂水平比較

表4顯示，模型組較正常組血HDL-C 降低(P<0.01)，TC、TG、LDL-C、FFA 均升高(P<0.01)；中藥組、貝特組血HDL-C 升高(P<0.01)，TC、TG、LDL-C、FFA均降低(P<0.01)。

組 別鼠數HOMA-IRISI胰腺TG含量(μmol/g)正常組814．82±4．05 -5．77±0．314．59±1．17模型組836．20±8．08??-6．68±0．22??7．21±0．78??中藥組818．02±5．29▲▲-5．95±0．39▲▲5．39±1．37▲▲貝特組818．62±5．86▲▲-5．98±0．41▲▲5．54±0．92▲▲

注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲▲P<0.01

組 別鼠數TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)FFA(mmol/L)正常組83．16±0．731．54±0．141．62±0．360．50±0．110．68±0．12模型組84．61±0．94??2．49±0．26??3．02±0．61??0．30±0．072??1．62±0．37??中藥組83．42±0．67▲2．04±0．22▲▲2．08±0．57▲▲0．33±0．051．09±0．19▲▲貝特組83．49±0．62▲1．98±0．18▲▲2．03±0．39▲▲0．35±0．081．00±0．25▲▲

注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01

圖3 各組大鼠胰腺組織病理學結果比較(HE染色×400)注：A.正常組；B.模型組；C.中藥組；D.貝特組

2．5 胰腺組織電鏡結果

正常組大鼠胰島β細胞核(圖4A)呈規則卵圓形，胞漿內散在分布線粒體、內質網結構清晰，大量分泌顆粒散布于胞漿內，分泌顆粒呈圓形且密集，外有界膜包繞，內有清晰、明亮的暈。模型組胰島β細胞核(圖4B)縮小、不規則，染色質邊集，有大量類圓形電子密度較小的脂滴堆積，胞漿內分泌顆粒顯著減少。中藥組胰島β細胞核(圖4C)形態尚規則，核仁清晰，胞漿內脂滴沉積較模型組少，分泌顆粒數量比模型組多。貝特組胰島β細胞核(圖4D)形態尚規則，少量染色質邊集，有少量脂滴沉積，分泌顆粒數量較模型組多。

圖4 胰腺組織電子顯微鏡觀察(電子顯微鏡×5000)注：A.正常組；B.模型組；C.中藥組；D.貝特組

2.6 各組大鼠胰島β細胞凋亡指數比較

圖5、6顯示，細胞凋亡指數在模型組升高，明顯高于正常組(P<0.01)，而與模型組比較，各治療組的細胞凋亡指數均下降(P<0.05)。通過均數分析胰腺脂肪含量和胰島β細胞凋亡指數的相關性，發現二者呈正相關(r=0.993，P=0.004)。

圖5 各組大鼠胰島β細胞凋亡指數

圖6 胰腺脂肪含量和胰島β細胞凋亡指數的相關性

2.8 胰腺Bcl-2、Bax蛋白表達

圖7、8顯示，Western blot檢測發現，模型組胰腺Bcl-2蛋白表達較正常組明顯下調，Bax蛋白表達明顯上調(P<0.01)，而各治療組胰腺Bcl-2蛋白表達明顯上調，Bax蛋白表達明顯下調(P<0.01)。

3 討論

非脂肪組織過多的脂肪沉積和高FFA與T2DM的發生密切相關。一方面FFA在外周的胰島素敏感組織如骨骼肌、脂肪中，使胰島素信號傳導發生障礙，另一方面可使分泌的胰島素增多，并代償性導致胰島細胞增生。隨著疾病的發展，胰腺中沉積的脂肪越來越多，β細胞的功能因此發生障礙甚至可引起細胞凋亡，2型糖尿病的發生即基于此。有學者研究，胰腺TG含量在正常血糖肥胖、糖耐量受損和T2DM患者中逐漸升高，且與β細胞功能呈負相關[3]。同時離體實驗表明，長期暴露于高濃度FFA中，β細胞葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，細胞內TG含量增加[4]。動物實驗則發現，Zucker肥胖大鼠整個胰腺內均出現脂肪沉積，且發生在血糖升高之前[5]。

中醫理論認為，長期高脂飲食導致內消中滿，中滿生內熱，內熱傷陰耗氣導致氣陰兩虛，引起細胞死亡，導致糖尿病的發生。因此，糖尿病以陰虛或氣陰兩虛為根本。國內大量研究認為，益氣養陰中藥或復方具有治療糖尿病、抑制胰島細胞凋亡的作用。如鄭燕芳等研究表明，具有益氣養陰的中藥石斛合劑、生脈飲、玉液湯等均具有抑制離體培養的胰島細胞凋亡的作用[6]。趙靜等學者則認為，生地、黃連單藥及配伍均能夠抑制T2DM模型大鼠胰島細胞凋亡[7]。

本研究中，高脂血癥和胰島素抵抗大鼠模型是通過長期高脂飲食喂養而成功誘導，表現為糖耐量異常、高胰島素血癥、胰島素抵抗指數升高和敏感指數降低、血清FFA升高。胰腺組織HE染色觀察發現，胰島細胞的變化主要表現在數量的減少，形態由類圓形變為不規則，細胞出現空泡樣改變，脂肪浸潤較重， TG含量也隨之升高。電子顯微鏡觀察雖現典型的凋亡小體，但發現模型組大鼠胰島β細胞出現染色質邊集，有大量類圓形電子密度較小的脂滴堆積，胞漿內分泌顆粒減少等凋亡早期表現。且通過TUNEL熒光雙染色發現，模型組β細胞凋亡指數明顯增加，而經活血降糖飲治療后，β細胞凋亡明顯改善。在本研究中，我們首次證實活血降糖飲治療T2DM的機制之一可能是減輕β細胞凋亡，這可能與減少胰腺脂肪含量和脂毒性相關。

Bcl-2家族蛋白位于線粒體的外膜，對于調節細胞凋亡具有重要作用。當各種致凋亡因子作用于細胞，導致線粒體抗凋亡和促凋亡基因表達失衡，可能影響線粒體的穩態，引起線粒體釋放細胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)，胞漿中的Cyt C在ATP/dATP存在的情況下，可以與凋亡蛋白酶活化因子1(Apoptotic Protease Activating Factor-1, Apaf-1)結

圖7 各組大鼠胰腺組織中Bcl-2蛋白的表達注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲▲P<0.01

圖8 各組大鼠胰腺組織中Bax蛋白的表達注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:▲▲P<0.01

合，形成Cyt C/Apaf-1復合體，募集胞漿中的Caspase 9前體，啟動Caspase級聯反應，引起細胞凋亡[8]。國外有學者報道，離體人胰島細胞在1.0-2.0mmol/L的FFA環境中培養48 h，細胞凋亡比例隨FFA濃度增加而提高[9]。胞內Bcl-2表達下調，但Bax無變化，如果阻斷Caspase級聯反應則能阻止FFA誘導的細胞凋亡，說明高濃度FFA誘導的細胞凋亡主要由線粒體凋亡途徑調控[10]。Shimabukuro M等學者研究也認為，高FFA暴露會下調Bcl-2表達[11]。本研究結果表明，長期高脂飼料喂養會導致胰島β細胞凋亡，胰腺Bcl-2蛋白表達下調，Bax蛋白表達上調，而經活血降糖飲治療后β細胞凋亡明顯改善， Bcl-2/Bax的失衡得到回調，說明活血降糖飲抗凋亡的作用可能是通過調節線粒體途徑發揮作用。

綜上所述，活血降糖飲能夠抑制高脂飲食誘導的大鼠胰腺脂肪沉積和胰島細胞凋亡，其可能的作用機制是與調節細胞凋亡線粒體途徑中的Bcl-2和Bax蛋白表達有關。

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Effects of Huoxue Jiangtang Decoction on Apoptosis of Islet β Cells in Rats Fed with High Fat Diet

CHU Shu-fang, LI Hui-lin△，LIU De-liang，ZHAO Heng-xia
(GuangzhouUniversityofChineseMedicineClinicalMedicalCollegeofShenzhen，ShenzhenTraditionalChineseMedicineHospital)，GuangdongShenzhen518033，China)

Objective: To study the molecular mechanism and effect of Huoxue-Jiangtang prescription on inhibiting pancreatic β cell apoptosis in hyperlipidemia and insulin resistance rats．Methods: High fat diet for 28 weeks, in order to establish the rat model of hyperlipidemia and insulin resistance.The model rats were randomly assigned to model group，the traditional Chinese medicine group (Huoxue-Jiangtang prescription) and fenofibrate group．Corresponding therapy were given through gastric tube for rats in different treatment groups. Meanwhile a control group was set up in normal animals. Oral glucose tolerance test (OGTT),insulin releasing test (IRT)，serum lipid level, and apoptosis related proteins were detected. Histology and fat content of pancreas were examined，TUNEL and electron microscope were used to evaluate pancreatic β cell apoptosis．Results: In contrast to the control group, the TG content and protein expression of Bax in pancreas tissue were increased, and pancreas fat deposition and early β cell apoptosis were found in model group, Meanwhile, β cell apoptosis index was increased while protein expression of Bcl-2 was reduced in model group. In comparison with model group, the TG content and protein expression of Bax were decreased in pancreas, pancreas fat deposition and cell apoptosis index was decreased in Huoxue-Jiangtang decoction treated group. Besides, the protein expression of Bcl-2 was increased in Huoxue-Jiangtang decoction treated group. Correlation analysis revealed that β cell apoptosis index was positively correlated with pancreas TG content. Conclusion: It suggested that Huoxue-Jiangtang prescription is effective on treating hyperlipidemia and insulin resistance in rats．The mechanism of preventing β cell apoptosis may be related to the regulation of protein expression of Bcl-2 and Bax in pancreas.

Huoxue-Jiangtang Prescription; Hyperlipidemia; insulin resistance; pancreatic β cell apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81173253)-益氣養陰活血中藥對胰島-β細胞脂凋亡的影響

楚淑芳(1984- )，女，在讀博士，從事中醫藥防治內分泌及代謝性疾病的臨床與研究。

△通訊作者：李惠林(1963- )，男，主任醫師，教授，從事中醫藥防治內分泌及代謝性疾病的臨床與研究，Tel: 13602666389， Email:sztcmlhl@163.com

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0496-04

2016-06-11