黃芪多糖抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體機制研究?

范宗靜,謝連娣,董巧稚,崔 杰,劉 洋,吳 旸,逯金金

(北京中醫藥大學東方醫院心血管科,北京 100078)

【實驗研究】

黃芪多糖抗心肌缺血再灌注損傷的線粒體機制研究?

范宗靜,謝連娣,董巧稚,崔 杰,劉 洋,吳 旸△,逯金金

(北京中醫藥大學東方醫院心血管科,北京 100078)

目的：通過觀察黃芪多糖對缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體膜電位、膜通透性轉換孔(mPTP)活性及鈣離子濃度等指標的影響，以探索黃芪多糖產生心肌保護作用的線粒體機制。方法：健康成年SD雄性大鼠35只分為假手術組、缺血再灌注組、黃芪多糖預處理組、黃芪多糖后處理組、陽性藥物腺苷對照組各7只，采用冠狀動脈結扎的方法建立大鼠心肌缺血模型，測定心肌線粒體膜電位、線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)活性、線粒體鈣離子濃度及ROS水平等指標。結果：與假手術組比較，缺血再灌注損傷組線粒體膜電位、mPTP的開放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平均顯著升高，而經黃芪多糖處理后線粒體膜電位、mPTP的開放程度、線粒體鈣離子濃度及ROS水平明顯降低。結論：黃芪多糖可通過減輕鈣超載，減少ROS 產生，降低膜電位水平及抑制mPTP 過度開放，從而減輕缺血再灌注損傷對線粒體膜結構的破壞，保護線粒體功能，進而保護心臟舒縮功能。

心肌缺血再灌注損傷;線粒體;黃芪多糖

心肌缺血再灌注損傷[1](myocardial ischemia reperfusion mjury，MIRI)，是指心肌缺血后在恢復循環的早期所出現的較缺血時更為嚴重的心肌損害，臨床表現多種多樣，常見的表現為心律失常、血壓驟降、心功能不全甚至猝死等病情加重的現象。MIRI可引起一系列線粒體功能紊亂現象，包括mPTP的開放、線粒體基質Ca2+超載以及ROS的產生等。中藥在治療 MIRI 方面前景廣闊[2]。黃芪多糖從黃芪中分離萃取，臨床應用廣泛，目前其研究具有顯著的心肌保護作用[3-4]。本研究應用最佳作用濃度的黃芪多糖，通過制作大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，并以心肌線粒體作為研究靶點，觀察黃芪多糖對心肌線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△Ψm)、線粒體膜通透性轉換孔(Mitochondrial permeability transitionpore，mPTP)活性等指標的作用，從細胞線粒體層面研究黃芪多糖對心肌保護作用的機制，為其應用于臨床提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

健康成年SD雄性大鼠35只(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號SCXK(京)2012-0001)，體質量300～350 g，實驗前大鼠觀察馴養3 d，喂飼普通基礎飼料并保持環境安靜。

1.2 試劑

5 μmol/L魚藤酮，5 mmol/L琥珀酸，0.25 mol/L蔗糖，0.1 mol/L Tris-HCl，110 mmol/L KCI，5 mmol/L KH2PO4。HEPES、咪唑、EDTA、CaCl2均購自Sigma 公司。

1.3 儀器設備

Sp-Ⅲ心電監護儀(由美國COLIN公司提供)，TKR-200C小型動物呼吸機(由江西特力麻醉呼吸設備公司提供)，低溫超速離心機(BECKMEN公司)，電動玻璃勻漿器(購自寧波新芝科器研究所)，生物醫學信號采集處理系統(由北京微信斯達科技發展有限責任公司提供)，原子吸收分光光度計 (購自AA-6601F，島津)，VIS-723分光光度計(購自上海精密科學儀器有限公司)，電子天平(由梅特勒-托利多儀器有限公司提供)。

2 方法

2.1 缺血再灌注模型的制備

將大鼠麻醉后進行氣管插管連接動物呼吸機，調呼吸比2∶1，潮氣量6～8 mL，頻率80次/min，多導聯心電監測。開胸暴露心臟，并找到分離左冠狀動脈前降支，以5-0無創縫合線穿過血管，阻斷左冠狀動脈前降支血流，心電圖顯示ST段抬高(>0．15 mv)，說明結扎成功；再灌注時解開活結，即可使阻斷的左冠狀動脈前降支血流再通，缺血再灌注模型建立，每次都由同一人完成操作步驟。

2.2 動物分組

將35只大鼠按隨機數字表法分成5組各7只。假手術組僅于冠狀動脈左前降支穿線但不結扎，并于穿線前和再灌給予等量生理鹽水。缺血再灌注組結扎冠狀動脈左前降支，阻斷血流120 min，再灌注60 min，此組不給藥。黃芪多糖預處理組阻斷血流前立即髂靜脈給予黃芪多糖(30 mg/kg)5 min推入，結扎120 min后進行再灌注，再灌注60 min后給予相應容積的生理鹽水。黃芪多糖后處理組阻斷血流前立即給予相應容積的生理鹽水，結扎120 min后進行再灌注，并于60 min后給予黃芪多糖(30 mg/kg)5 min推入。陽性藥物對照組阻斷血流前立即經髂靜脈給予腺苷(305 μg/kg/min)5 min內推入，并于120 min后進行再灌注，60 min后給予相應容積的生理鹽水。

2.3 大鼠心肌線粒體提取

再灌結束后剪碎心肌組織，置于7 ml 0.3 mmol/L蔗糖、10 mmol/L咪唑(pH 7.4，4℃)溶液中進行研磨，離心10 min后取上清液，再次離心20 min得到少量沉淀物，然后用洗液(成分為25 mmol/L蔗糖，75 mmol/L甘露糖，50 μmol/L EGTA，O.1 mol/L KCI，pH 7.4，4℃)洗1遍，再次離心20 min，沉淀物即為心肌線粒體。并對線粒體活性及純度進行琥珀酸脫氫酶測定。通過透射電鏡觀察線粒體超微結構并進行照片分析。

2.4 大鼠線粒體膜電位測定

取線粒體膜電位測定反應介質2 ml并進行混勻，測定熒光值(F1)，發射波長設定為525 nm，激發波長設定為500 nm；測試后加入線粒體懸液100 μl進行5 min25℃孵育，然后加入100 nmol CaCl2使線粒體腫脹；進行5 min離心提取上清，然后測熒光值(F2)，計算每毫克線粒體所引起熒光值的變化[(ΔF)=(F1-F2)/(mg prot)]，從而反映線粒體ΔΨm。

2.5 線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)活性測定

先在石英杯中加入反應緩沖液2 ml，然后加入濃度0.5 mg/ml的線粒體100 μl，25℃孵育2 min后，加入100 nmol CaCl2誘發線粒體腫脹。在540 nm波長下，用分光光度計測定加入CaCl2即刻的吸光度值(A0)和10 min時的吸光度值(A10)，計算吸光度值的差值(ΔA540=A0-A10)，表示MPTP的活性，以反映線粒體通透性轉換的程度。

Ca2+作為常用的mPTP 開放誘導劑，用Ca2+進行誘導后測定mPTP 的變化能力，可反映線粒體mPTP 的初始狀態。將線粒體置于高Ca2+濃度體系中，Ca2+通過誘導mPTP的開放引起線粒體膨脹，使線粒體的吸光度在10 min 內逐漸減小。線粒體的吸光度值減少越小，說明Ca2+誘導的mPTP 開放程度越小，mPTP 的初始狀態開放程度越大。相反，線粒體的吸光度值減少越大，說明Ca2+誘導的mPTP 開放程度越大，mPTP 的初始狀態開放越少。

2.6 線粒體鈣離子濃度測定

每組中分別取線粒體懸液1.5 ml置于10 ml的加蓋刻度試管中，然后加入5 ml濃硝酸置于陰暗處硝化1周。烘箱加熱使硝酸分解蒸發，并加入1%的氯化鑭至10 ml混勻制成樣品。用分光光度計測吸收光密度并計算濃度。

2.7 活性氧簇水平(ROS)測定

將心肌組織制成單細胞懸液，再用DMEM培養液懸浮分散細胞并進行培養，觀察到細胞成片搏動后將用于實驗。各組細胞均加入ROS熒光標記，空白對照孔不做任何處理。用PBS清洗細胞吹打后收集，然后用流式細胞儀檢測細胞內ROS水平。各實驗組分析所用ROS水平為該實驗組流式細胞儀所測值減去空白對照孔的基礎值。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 各組心肌線粒體膜電位比較

表1顯示，經測定反應介質的熒光值F1=442.48，假手術組的線粒體熒光值最高，缺血再灌注損傷組的熒光值最低，從而得出線粒體膜電位在假手術組中最低，在缺血再灌注損傷組中最高。黃芪多糖后處理組和預處理組線粒體膜電位水平較缺血再灌注損傷組的膜電位均有所減低(P<0.05)。

表1 各組大鼠心肌線粒體膜電位比較

組 別鼠數F1?F2ΔΨm假手術組7416 1121 42±3 68缺血再灌注組7399 4343 05±6 63?黃芪多糖預處理組7410 9031 58±3 84?△黃芪多糖后處理組7407 8638 14±8 00?△腺苷組7409 2743 78±17 00?

注：與假手術比較：*P<0.05；與缺血再灌注組比較:△P<0.05

3.2 各組大鼠心肌線粒體mPTP活性、心肌細胞活性氧簇水平(ROS)以及線粒體鈣離子濃度比較

表2顯示，假手術組mPTP的活性最高，缺血再灌注損傷組mPTP的活性最低，黃芪多糖預處理組和黃芪多糖后處理組以及腺苷組的mPTP活性均較缺血再灌注損傷組的活性高(P<0.05)，提示黃芪多糖能夠模擬陽性藥物腺苷抑制mPTP的開放。

表2顯示，假手術組的鈣離子濃度最低，而缺血再灌注損傷組的鈣離子濃度最高。黃芪多糖預處理組和后處理組與缺血再灌注損傷組比較，線粒體鈣離子濃度均減低(P<0.05)。黃芪多糖預處理組的鈣離子濃度低于黃芪多糖后處理組，差異有統計學意義。

表2顯示，缺血再灌注損傷與假手術組比較ROS顯著增高。黃芪多糖預處理組和后處理組以及腺苷組3組均較缺血再灌注損傷組ROS明顯降低。預處理組與較后處理組和腺苷組比較，ROS也有所降低，差異有統計學意義。

表2 各組大鼠心肌線粒體mPTP活性比較

注：與假手術組比較:*P<0.05;與缺血再灌注組比較:△P<0.05;與黃芪多糖后處理組比較:※P<0.01;與黃芪多糖預處理組比較:#P<0.05

4 討論

黃芪多糖是黃芪的有效活性成分之一，經過高科技多道工藝萃取，目前已證實其具有心肌保護作用，然而其心肌保護的具體細胞信號傳導機制尚不清楚，尤其是心肌線粒體途徑研究目前還比較少。

線粒體在調節活性氧的生成、細胞凋亡、鈣穩態中扮演著關鍵角色，線粒體的完整性對心肌細胞存活至關重要[5]，目前已成為心肌保護的重要靶點。MIRI能引起線粒體功能障礙，包括心肌能量合成受阻，膜電位的下降、鈣超載、離子穩態失衡及自由基大量產生等。MIRI過程使線粒體的各種穩態平衡均發生嚴重改變，這些因素相互影響并形成惡性循環，從多種途徑參與MIRI的發生[6]。

mPTP是線粒體進行氧化應激、細胞呼吸、合成ATP等生命活動的必要條件，也是影響線粒體穩定性和細胞功能的關鍵因素，是MIRI后心肌細胞損傷的重要原因7-8]。mPTP的持續開放可損傷細胞線粒體[9-10]，在某些生理情況下mPTP 呈關閉狀態，而線粒體內膜只是對某些代謝底物及離子存在選擇性通透。當在應激時mPTP 呈開放狀態，會允許相對分子質量<1500 的小分子通過，從而導致線粒體質滲透壓的升高，而引起線粒體基質水腫、外膜損傷、促細胞凋亡因子及細胞色素C等釋放。同時，呼吸鏈與氧化磷酸化解偶聯，并使線粒體跨膜電位消失，ATP合成停止，致使心肌細胞的死亡[11]。

當缺血再灌注發生時，離體心肌細胞線粒體內會產生大量的ROS，導致心肌細胞的損傷。心肌損傷的機制包括細胞膜的脂質過氧化作用、蛋白質變性及基因組DNA斷裂。最近有研究結果表明，△Ψm在MIRI時異常去極化與ROS的破壞作用同時發生[12]，ROS的增加和再灌注后使ΔΨm 快速復極化，從而誘發線粒體內膜通透性升高，導致mPTP的持續開放，mPTP的開放則會誘發細胞質中Ca+大量流入到線粒體內，引起細胞質內鈣超載，導致線粒體膜結構受損[13]，引發線粒體功能障礙。所以，線粒體內mPTP開放的、Ca+超載與 ROS的損傷互相作用，形成惡性循環。

本研究顯示，經黃芪多糖預處理或后處理后，mPTP活性均較缺血再灌注損傷組的活性增高，線粒體的膜電位、鈣離子濃度及ROS的釋放均有所減低。進而推測黃芪多糖可以通過抑制鈣庫內鈣大量釋放減輕鈣超載，從而減輕缺血再灌注對線粒體呼吸功能的損害。此外，黃芪多糖使ROS產生減少，又進一步減輕ROS對線粒體膜結構的破壞，黃芪多糖抑制mPTP 過度開放，降低線粒體膜興奮性，從而保持線粒體內膜完整，保證線粒體ATP合成，保護線粒體功能并進一步改善心肌能量代謝，保護心臟舒縮功能。

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Astragalus Polysaccharides (APS) Protects Against Myocardial Ischemia-Reperfusion (I/R) Injury Through Mitochondrial Mechanisms

FAN Zong-jing, XIE Lian-di, DONG Qiao-zhi,CUI Jie, LIU Yang, WU Yang△,LU Jin-jin
(DongFangHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China)

Objective: To investigate the mitochondrial mechanisms of Astragalus Polysaccharides (APS) therapy by observing the effects on the expression of the mitochondrial membrane potential (MMP), the active of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) and the concentration of calciumion in rats with myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury. Methods: Thirty five (35) male Sprague-Dauley (SD) rats were randomly divided into the following 5 groups: sham operation group, I/R injury group, APS pre-treatment group, APS post-treatment group and adenosine control group. We measure the levels of MMP, the concentration of calciumion, the level of reactive oxygen species (ROS), andtheactiveofmPTP. Results: Compared with the sham operation group, the I/R injury group showed significantly increase with the levels of MMP, the concentration of calciumion, the level of reactive oxygen species (ROS), andtheactiveofmPTP. Compared with the I/R injury group, the APS pre-treatment group and the APS post-treatment group showed significantly decrease in all these indicators. Conclusion: APS play a protecting role on cardiac function through protecting the function of mitochondria, which byreducingthe levels of ROS,theconcentrationofacalciumion,thelevelofMMP, andinhibitingtheopening ofmPTP.

Myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI); Mitochondrium;Astragalus polysaccharides

國家自然科學基金面上項目(81573900)-黃芪多糖對缺血再灌注損傷人微血管內皮細胞線粒體分裂以及凋亡的影響；國家自然科學基金青年基金項目(81102573)-黃芪多糖對缺血再灌注損傷大鼠心肌線粒體mPTP開放及其調控因素的影響;北京中醫藥大學中青年教師類課題面上項目(2015-JYB-JSMS10)-黃芪多糖后處理對缺血再灌注損傷人心肌細胞線粒體通透性轉換孔道(mPTP)開放等作用的研究

范宗靜(1983-)，女(滿族)，河北承德人，主治醫師，醫學碩士，從事中西醫結合心血管疾病的防治與研究。

△通訊作者：吳 旸，男，主任醫師，醫學博士，碩士研究生導師，從事中西醫結合心血管疾病的防治與研究，Tel：010-67689756，E-mail：drwuyang@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)04-0484-04

2016-10-17