新血府逐瘀湯對動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠主動(dòng)脈形態(tài)及免疫調(diào)節(jié)因子HMGB-1、 Foxp3表達(dá)的影響?

姜 婷，紀(jì)文巖△，隋永妮，劉妮娜，吉中強(qiáng)

(1.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)(青島市中醫(yī)醫(yī)院)，山東 青島 266033;2.青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042)

【實(shí)驗(yàn)研究】

新血府逐瘀湯對動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠主動(dòng)脈形態(tài)及免疫調(diào)節(jié)因子HMGB-1、 Foxp3表達(dá)的影響?

姜 婷1，紀(jì)文巖1△，隋永妮2，劉妮娜1，吉中強(qiáng)1

(1.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)(青島市中醫(yī)醫(yī)院)，山東 青島 266033;2.青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042)

目的: 觀察新血府逐瘀湯對動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠主動(dòng)脈HMGB-1、Foxp3表達(dá)及病理形態(tài)學(xué)影響，探討其調(diào)節(jié)免疫因子抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。方法: 雄性SPF級Wistar大鼠48只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、立普妥組、新血府逐瘀湯(NXFZY)低劑量組、NXFZY高劑量組及NXFZY+立普妥組。除空白組外，其余各組復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化模型，NXFZY低劑量組新血府逐瘀湯9 g/(kg·d)、NXFZY高劑量組新血府逐瘀湯18g/(kg·d)灌胃，立普妥組給予阿托伐他汀鈣2 mg/(kg·d)水溶液灌胃，對照組及模型組灌服等容積生理鹽水，8周后HE染色后鏡下觀察胸主動(dòng)脈病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)法檢測胸主動(dòng)脈HMGB-1、Foxp3表達(dá)并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果: 與模型組比較，新血府逐瘀湯可顯著降低HMGB-1表達(dá)，升高Foxp3表達(dá)，兩者存在顯著負(fù)相關(guān)性。結(jié)論：新血府逐瘀湯可通過下調(diào)促炎因子HMGB-1、上調(diào)抗炎因子Foxp3表達(dá)，調(diào)節(jié)AS過程中促炎與抗炎因子之間的平衡，發(fā)揮抗AS的作用。

新血府逐瘀湯；動(dòng)脈粥樣硬化；免疫調(diào)節(jié)因子；高遷移率族蛋白B1；叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3

免疫與炎癥是目前防治動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的公認(rèn)靶點(diǎn)[1]，抗炎因素與致炎因素的相互作用決定AS發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程[2]。他汀類調(diào)脂藥物雖然也有抑制免疫炎癥的作用，但因肝腎功能及肌肉損害等問題一定程度上限制了此類藥物的應(yīng)用范圍[3]，因此如何發(fā)揮中藥復(fù)方在抗AS中的多靶點(diǎn)協(xié)同作用優(yōu)勢，值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)觀察新血府逐瘀湯(NXFZY)對AS大鼠主動(dòng)脈免疫調(diào)節(jié)因子高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB-1)、叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxp3)表達(dá)影響及病理形態(tài)學(xué)改變，探討其抗AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，符合一級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(動(dòng)物合格證號SCXK(魯)20130004)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1 中藥 新血府逐瘀湯組成：桃仁12 g，紅花、生地、當(dāng)歸、澤瀉、牛膝、首烏各9 g，枳實(shí)、赤芍、生山楂各6 g，川芎4.5 g。經(jīng)浸泡、煎煮、過濾、濃縮制成煎劑，真空包裝，其中高、低劑量每毫升含生藥分別為2.0 g、1.0 g，低溫冷藏備用。

1.2.2 西藥 阿托伐他汀鈣(立普妥，10 mg/片，美國輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號1337119)，丙硫氧嘧啶(上海朝暉，生產(chǎn)批號1307F02)，注射用維生素 D3(上海通用制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號12115)。

1.3 主要試劑及儀器

Rb polyclonal to HMGB-1Antibody (abcam，批號GR93186-2)，工作濃度1∶50；Ms polyclonal to Foxp3 Antibody (abcam，批號GR146107-3)，工作濃度1∶50；羊抗兔二抗(abcam，批號GR101082-1)，工作濃度為1∶500；羊抗鼠二抗(abcam，批號GR101081-1)，工作濃度1∶500；兔抗羊二抗(abcam，批號GR101083-1)，工作濃度1∶500。DAB顯色試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)、光學(xué)顯微鏡(BX43型，OLYMPUS公司)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2235型，LEICA公司)、病理組織漂烘儀(tec 2500型，常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司)等。

2 方法

2.1 分組及造模

常規(guī)飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只雄性Wistar大鼠分成對照組、模型組、立普妥組、NXFZY低劑量組、NXFZY高劑量組和NXFZY+立普妥組6組各8只。對照組進(jìn)食基礎(chǔ)飼料(53%碳水化合物，9%脂肪，21%蛋白質(zhì))，其余各組喂食高脂飼料(1%膽固醇，5%豬油，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶，93.3%普通飼料)直至取材。建模采用文獻(xiàn)[4]的方法，模型組及藥物干預(yù)組大鼠從實(shí)驗(yàn)第1天開始即喂食高脂飼料，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)腹腔注射維生素D3(每次注射17.5萬IU/kg，隔2 d注射1次，共注射4次)。

2.2 給藥

造模第3周后，NXFZY低、高劑量組分別以新血府逐瘀湯低劑量、高劑量煎劑10 ml/(kg·d)灌胃，qd；立普妥組給予阿托伐他汀鈣2 mg/(kg·d)水溶液灌胃，qd；NXFZY+立普妥組上述2種方案相加給藥；對照組及模型組則分別灌服等容積生理鹽水；連續(xù)灌胃8周，每周稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥量。

2.3 組織病理學(xué)觀察

8周后麻醉大鼠，切開胸腹常規(guī)貼片、脫臘、HE染色，用ipp6.0專業(yè)圖像分析軟件測量胸主動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜厚度。

2.4 免疫組化法檢測HMGB-1、Foxp3表達(dá)

按試劑盒說明步驟進(jìn)行免疫組化染色，每張免疫組化切片隨機(jī)選擇3個(gè)不同的視野(×200)微鏡下觀察，染色結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[5]中的方法，對每個(gè)視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分與陽性細(xì)胞百分比乘積評分，評價(jià)其陽性表達(dá)強(qiáng)度及陽性率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中3只大鼠死亡，因灌藥不慎導(dǎo)致立普妥組和NXFZY高劑量組各有1只老鼠死亡，另有模型組1只老鼠死于腹瀉。

3.1 6組大鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察

圖1顯示，各組大鼠胸主動(dòng)脈給予HE染色后進(jìn)行鏡下觀察，大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜顯著增厚，中膜平滑肌細(xì)胞增殖，可見脂質(zhì)斑塊和泡沫細(xì)胞積聚及壞死深染物質(zhì)，動(dòng)脈壁三層結(jié)構(gòu)紊亂，提示AS模型建立成功；各治療組主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變程度較模型組不同程度減輕，尤其是NXFZY+立普妥組主動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列較為規(guī)則，未見硬化斑塊產(chǎn)生，各層結(jié)構(gòu)尚清晰，提示新血府逐瘀湯與阿托伐他汀鈣聯(lián)用能有效抑制AS斑塊的形成。

3.2 6組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜厚度比較

表1顯示，與模型組比較，立普妥組、NXFZY高劑量組、NXFZY+立普妥組內(nèi)膜及中膜厚度不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；其中NXFZY+立普妥組降低內(nèi)膜及中膜厚度較單純立普妥組更明顯(P<0.05)；NXFZY高劑量組內(nèi)膜厚度低于NXFZY低劑量組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3 免疫組化法檢測6組大鼠胸主動(dòng)脈HMGB-1、Foxp3表達(dá)結(jié)果

表1圖2、3顯示，與空白組比較，模型組HMGB-1陽性表達(dá)明顯增高，F(xiàn)oxp3顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各治療組HMGB-1陽性表達(dá)水平不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，其中NXFZY高劑量組與NXFZY+立普妥組HMGB-1水平降低明顯(P<0.01)；NXFZY高劑量組、NXFZY+立普妥組Foxp3陽性表達(dá)升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。組間比較，NXFZY+立普妥組降低HMGB-1，升高Foxp3陽性表達(dá)水平，與單純立普妥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NXFZY高劑量組HMGB-1陽性表達(dá)水平低于NXFZY低劑量組(P<0.05)，F(xiàn)oxp3陽性表達(dá)均值較低劑量組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.175)。

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察(×200)注：A.對照組；B.模型組；C.立普妥組；D.NXFZY低劑量組；E.NXFZY高劑量組；F.NXFZY+立普妥組

組 別例數(shù)內(nèi)膜厚度/pixel中膜厚度/pixelHMGB?1Foxp3空白組873 24±18 335358 33±39 5424 12±0 4856 47±1 328模型組792 43±8 084△△474 24±52 774△△6 10±1 518△△4 30±1 490△△立普妥組781 38±6 764▲434 86±81 841▲5 14±1 621▲4 76±1 179NXFZY低劑量組888 67±8 331445 61±83 4995 25±1 422▲4 75±1 422NXFZY高劑量組780 43±15 977▲?427 81±49 813▲4 38±1 499▲▲?5 33±1 932▲NXFZY+立普妥組873 08±14 301▲▲●387 83±60 514▲▲●4 29±1 301▲▲●5 67±1 404▲▲●

注：與空白組比較:△△P<0.01；與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01；與立普妥組比較:●P<0.05；與NXFZY低劑量組比較:*P<0.05

圖2 各組大鼠胸主動(dòng)脈HMGB-1表達(dá)(×200)注：A.對照組；B.模型組；C.立普妥組；D.NXFZY低劑量組；E.NXFZY高劑量組；F.NXFZY+立普妥組

圖3 各組大鼠胸主動(dòng)脈Foxp3表達(dá)(×200)注：A.對照組；B.模型組；C.立普妥組；D.NXFZY低劑量組；E.NXFZY高劑量組；F.NXFZY+立普妥組

3.4 動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈HMGB-1、Foxp3的相關(guān)性分析

分析45只AS大鼠主動(dòng)脈HMGB-1、Foxp3陽性表達(dá)評分結(jié)果相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者之間相關(guān)系數(shù)(r=-0.627)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

4 討論

AS是一種多種免疫因素參與、復(fù)雜的慢性炎癥性疾病[6]，炎癥貫穿于AS發(fā)生、發(fā)展、變化的全過程，決定著AS的進(jìn)展及斑塊穩(wěn)定[7]。Kalinina等[8]首次發(fā)，現(xiàn)高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB-1)在AS病變中表達(dá)增高，是參與AS慢性炎癥進(jìn)程中重要的炎癥介質(zhì)之一。而在抑制AS形成過程中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)及其分泌的細(xì)胞因子在負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面起了重要作用。叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3(Foxp3)在CD4+CD25調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的功能上發(fā)揮著重要作用，是Treg的一個(gè)相對特異性標(biāo)記[9]。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)oxp3通過調(diào)控體內(nèi)炎癥而具有抗AS的作用[10]。

為在活血化瘀的基礎(chǔ)上使調(diào)達(dá)氣機(jī)之力更擅，且兼化痰降濁之功，在血府逐瘀湯的基礎(chǔ)上，以枳實(shí)替代桔梗、枳殼、柴胡，并加入何首烏、澤瀉、山楂化痰降濁之品組成新血府逐瘀湯。在前期研究中證實(shí)，新血府逐瘀湯在防治AS的進(jìn)程中具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血管內(nèi)皮炎癥等作用，以降低心血管事件的發(fā)生[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，AS模型大鼠在病理組織形態(tài)學(xué)改變的同時(shí)，HMGB-1陽性表達(dá)增高，考慮受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞和活化的炎性細(xì)胞可主動(dòng)釋放大量的HMGB-1，刺激臨近的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等[12]，而這些炎癥介質(zhì)可反向促進(jìn)HMGB1和其他炎性因子釋放，造成AS血管的HMGB1水平明顯高于正常血管[13]。而新血府逐瘀湯干預(yù)后，HMGB1陽性表達(dá)水平顯著降低。

新血府逐瘀湯在降低HMGB1陽性表達(dá)的同時(shí)，F(xiàn)oxp3陽性表達(dá)水平升高，提示Treg細(xì)胞的功能發(fā)揮得到改善。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。考慮新血府逐瘀湯可直接作用于HMGB1，抑制相關(guān)炎癥因子分泌發(fā)揮抗AS作用，同時(shí)HMGB1可通過影響Treg細(xì)胞功能干預(yù)AS的進(jìn)程。一方面HMGB1與Treg細(xì)胞上的TLR2、4結(jié)合抑制其功能發(fā)揮，加速AS的形成和發(fā)展；另一方面HMGB1可能激活Th17細(xì)胞，降低Foxp3的表達(dá)以及抑制IL-10的分泌，從而降低Tregs細(xì)胞的活性，導(dǎo)致細(xì)胞免疫平衡破壞使炎癥反應(yīng)維持及放大[14]。

總之，新血府逐瘀湯通過對HMGB1表達(dá)的抑制及Foxp3表達(dá)的促進(jìn)，調(diào)節(jié)促炎因子與抗炎因子之間的平衡，體現(xiàn)了中藥復(fù)方制劑多靶點(diǎn)、雙向調(diào)節(jié)作用的優(yōu)勢，值得進(jìn)一步探索與應(yīng)用。

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Effects of New Xuefu Zhuyu Decoction on the Expression of Immunomodulatory Factors HMGB-1 and Foxp3 in Atherosclerosis Model Rats

JIANG Ting1, JI Wen-yan1△, SUI Yong-ni2, LIU Ni-na1, JI Zhong-qiang1
(1.QingdaoHaiciMedicalGroup,Qingdao266033,China;2.QingdaoCentralHospital,Qingdao266042,China)

Objective: By observing the effect of New Xuefu Zhuyu Decoction on aorta pathologymorphology and HMGB-1, Foxp3 expression in atherosclerosis model rats, explore its anti atherosclerosis mechanism by the regulation of immune factors. Methods:48 healthy male Wistar rats were randomly divided into blank control group, model group, western medicine group, low dose Chinese medicine group, high dose Chinese medicine group, and the group of high dose Chinese medicine plus western medicine. Except the blank group, other groups were copied to atherosclerosis model, low dose group and high dose group of Chinese medicine gavaged with New Xuefu Zhuyu Decoction at a concentration of 9 g/ (kg·d) and 18g/ (kg·d) respectively; western medicine group with aqueous solution of atorvastatin calcium 2 mg/(kg·d); these two programs administered by adding for Integrative Medicine group; simultaneously, the control and the model group were fed with volume of normal saline. After 8 weeks, the thoracic aortic pathology change was observed under light microscope with HE staining; the HMGB-1, Foxp3 expression of thoracic aortic was detected by immunohistochemical method, and then their correlativity was analyzed. Results: Compared with the model group, the New Xuefu Zhuyu Decoction could decrease the expression of HMGB-1 and increase the expression of Foxp3, and the two have a significant negative correlation.Conclusion:New Xuefu Zhuyu Decoction could down regulate proinflammatory factor HMGB-1 and upregulation of anti-inflammatory factor Foxp3 expression, to play the role of anti atherosclerosis by regulating the balance of inflammatory factor.

New Xuefu Zhuyu Decoction; Atherosclerosis; Immune regulation factor; HMGB-1; Foxp3

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)(2013ZDZK-105)-新血府逐瘀軟膠囊對血瘀型心絞痛 FOXP3基因甲基化的干預(yù)研究；青島市醫(yī)藥科研指導(dǎo)計(jì)劃(2014-WJZD061)-新血府逐瘀湯干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)的研究

姜 婷(1984-)，女，山東青島人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者：紀(jì)文巖，Tel：0532-83777551，E-mail：jiwenyan@sina.com。

R285.5

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1006-3250(2017)04-0480-04

2016-12-22