動物免疫抗體產生因素的初步研究

魏 力，徐寧迎

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058)

動物免疫抗體產生因素的初步研究

魏 力，徐寧迎

(浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058)

動物的免疫保護效果受抗原劑量、濃度、佐劑、接種間隔時間以及抗體檢測方法等多種因素的影響。為確定試驗兔免疫過程中影響免疫效果的具體因素及其影響程度，優化兔子的免疫程序，筆者探究了佐劑、免疫次數和性別對供試兔免疫保護效果的影響。結果顯示：佐劑組新西蘭大白兔抗體水平顯著高于對照組(P<0.01)；不同性別組新西蘭大白兔的抗體滴度水平均隨免疫次數呈上升趨勢，組間上升趨勢相近(P>0.05)；同時，在一定范圍內，抗原活化B細胞產生的抗體水平與免疫次數呈正相關，但到達一定限度后抗體水平不再顯著上升。

抗原；免疫程序；抗體水平；佐劑；兔

免疫程序是根據動物年齡、疫苗種類、飼養目的等制定的免疫接種計劃，包括接種時間、接種劑量、接種途徑、接種次數等。免疫程序的選擇需多方面、綜合性考量，其結果可能受抗原、佐劑、接種間隔時間等多種因素影響。對于同種疫苗，不同的免疫程序對其免疫效果影響較大[1]。明確免疫程序中具體影響因素的作用，通過改進、優化免疫程序，對于收獲高效的免疫保護效果具有重要意義。

影響動物免疫保護效果的因素一般有疫苗質量、疫苗劑量、佐劑、免疫時間和次數等。佐劑與抗原同時或預先應用，能增強機體針對該抗原的免疫應答能力，對于提升抗原或疫苗的免疫保護效果起著重要作用[2]。首免時間和次數對于免疫保護效果的影響同樣較大[3]。此外，動物如果存在先天性免疫缺陷，或者感染某些可引起免疫抑制的病原(如PRRSV、IBDV等)，其免疫系統受損，也會最終影響免疫保護效果。

近年來，浙江、四川等地養兔產業蓬勃發展，部分養殖戶對于優化家兔免疫程序具有現實需求，同時關于家兔免疫保護效果影響因素的研究報道相對較少，本研究旨在探討抗原、佐劑、免疫次數和性別對家兔免疫效果的影響，以期為制定科學的免疫程序提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗兔購自杭州某兔業專業合作社，隨機選擇3月齡新西蘭大白兔60只(公母各30只)，體重2.5～2.6 kg。隨機分成6組，每組5只公兔、5只母兔，分別命名為PKC zeta+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2、PKC zeta、P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2、P300組(詳見表1)。

表1 試驗動物分組

1.2 抗原與佐劑 試驗選用PKC zeta與P300兩種抗原；FCA/FIA、Montanide ISA50 V2作為疫苗佐劑。其中FCA/FIA購自美國Sigma公司，Montanide ISA50 V2購自法國SEPPIC公司。

1.3 試驗方法 試驗期71 d，初免時間為第4 d，然后于第25 d、39 d、53 d和67 d進行第二至第五次的加強免疫，所有供試兔均于71 d時剖殺，采集血樣和脾臟，并于每次免疫前3 d采集血樣備用。每次免疫佐劑量為0.5 mL ，抗原量除第一次和第五次為0.5 mg外，其余均為0.25 mg，濃度為1 mg/mL。采用皮下分點注射免疫。

血清抗體水平檢測按ELISA試劑盒說明步驟檢測血清抗體水平，每份血清檢測3次。

2 結果與分析

2.1 佐劑和抗原對特異性IgG抗體水平的影響 詳見圖1、圖2。

圖1 血清中抗PKC zeta特異性IgG抗體的動態變化

由圖1可見，從二免開始至終免，PKC zeta+FCA/FIA組與PKC zeta+Montanide ISA50 V2組的抗體水平一直高于PKC zeta組，差異極顯著(P<0.01)，提示疫苗佐劑FCA/FIA與Montanide ISA50 V2均具有良好的免疫增強效果，且對PKC zeta抗原而言，佐劑FCA/FIA的免疫增強效果優于佐劑Montanide ISA50 V2。

圖2 血清中抗P300特異性IgG抗體的動態變化

由圖2可見，從二免開始至終免，除二免時P300與P300+FCA/FIA組抗體水平無顯著差異外(P>0.05)，其余各時期P300+FCA/FIA組與P300+Montanide ISA50 V2組抗體水平差異均顯著高于對照組P300組(P<0.05)，其中三免時P300+Montanide ISA50 V2組與P300組抗體水平差異極顯著(P<0.01)。結果提示佐劑FCA/FIA與Montanide ISA50 V2均具有較好的增強免疫應答效果，且對P300抗原，Montanide ISA50 V2佐劑的增強效果優于FCA/FIA佐劑。

2.2 動物性別對特異性IgG抗體水平的影響 詳見圖3。

由圖3可見，免疫抗原PKC zeta、PKC zeta+佐劑FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2免疫后，公、母兔抗體水平均呈上升趨勢，且兩種趨勢相近，差異不顯著(P>0.05)。免疫抗原P300免疫后，公、母兔抗體水平基本維持不變，兩者無顯著差異(P>0.05)；免疫P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2后，公、母兔抗體滴度水平均呈上升趨勢，兩者趨勢相近，差異不顯著(P>0.05)。

2.3 免疫次數對特異性IgG抗體水平的影響 詳見圖4。

由圖4可見，采用PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2、P300、P300+FCA/FIA、P300+Montanide ISA50 V2 6組抗原+佐劑免疫后，除抗原P300組的一免外，其他各組的抗體水平總體隨免疫次數呈上升趨勢，其中PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、P300+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2組的抗體水平上升趨勢呈線性上升，而P300+Montanide ISA50 V2組抗體水平則在三免前抗體水平呈線性上升，之后一直維持在較高水平。由此可見，隨著免疫次數的增加，動物抗體水平呈現上升趨勢，至一定限度后上升幅度漸趨平緩；提示在一定范圍內，抗原活化B細胞產生的抗體水平與免疫次數呈正相關，到達一定限度后，不再上升而是維持在較高水平；研究結果與克隆選擇理論基本一致。

3 小結與討論

抗原免疫保護效果受抗原劑量與濃度、佐劑、免疫接種間隔時間及抗體檢測方法等多種因素影響[4]。因此，明確每一種因素的影響效果，對合理優化抗原的免疫程序具有重要意義。筆者在本次試驗中著重探討了抗原、佐劑、免疫次數和動物性別對免疫保護效果的影響，以期為制定科學的免疫程序、進一步提高疫苗的免疫保護效果提供試驗依據。

圖3 不同性別新西蘭大白兔免疫PKC zeta、P300后特異性IgG抗體的動態變化

3.1 佐劑對于免疫保護效果具有重要影響 由圖1與圖2可知，抗原組的抗體水平顯著低于抗原+佐劑組的抗體水平，顯示了佐劑具有良好的免疫增強效果。使用佐劑FCA/FIA、Montanide ISA50 V2均能誘導強而持久的免疫保護效果，且兩者各具優勢，FCA/FIA作為經典的油包水佐劑，來源廣泛、價格經濟；而Montanide ISA50 V2乳劑非常穩定、易于注射且基本無副作用[5]。

3.2 動物性別對于免疫保護效果的影響不顯著 由圖3可知，同一抗原不同性別組的抗體水平之間無顯著性差異，顯示動物性別對免疫保護效果無明顯影響或影響不顯著。理論上認為，動物的免疫保護效果受抗原本身、佐劑、免疫程序、機體健康水平等多種因素的影響，性別因素則對其影響甚微，目前亦未見相關報道證實動物性別因素在免疫保護效果方面存在顯著影響。

3.3 免疫次數與免疫效果存在相關性 由圖3、圖4可知，在一定范圍內抗體水平與免疫次數呈正相關，達到一定限度后，抗體水平不再顯著上升而維持在較高水平。

圖4 不同免疫次數的新西蘭大白兔特異性IgG抗體的動態變化

鑒于動物性別對于抗原免疫保護效果的影響不顯著，故將同一抗原免疫的10只供試兔的相關數據合并統計，即每一組10只供試兔不再區分公母，一并統計。從圖4可知，隨著免疫次數的增加，試驗動物抗體水平亦不斷升高，如PKC zeta、PKC zeta+FCA/FIA、P300+FCA/FIA、PKC zeta+Montanide ISA50 V2組；比較特別的是，P300+Montanide ISA50 V2組抗體水平先隨免疫次數增加而增加，后維持較高水平不再上升。試驗結果表明：抗體水平達到一定限度后，抗體水平不再隨免疫次數增加而上升，而是維持在較高水平或趨緩慢上升，這與顧一峰等(2004)[6]對大鼠的相關研究結果相似。因此，為獲得較高的抗體水平不可一味加大免疫劑量，達一定限度后即使增加免疫劑量抗體水平也不再上升，有時還會加重動物的承載負擔，故應根據抗體監測水平決定免疫次數，適量免疫。推薦采用低劑量長程免疫的免疫方法為佳。

根據上述佐劑、性別、免疫次數對抗原免疫保護效果影響的試驗與分析，可以確定家兔免疫程序中佐劑、免疫次數和動物性別的作用，而且可從該角度出發經科學安排以提高抗原免疫保護效果。為獲得良好的免疫保護效果，建議可選擇適宜的免疫程序和佐劑、適當增加免疫次數來提高動物的免疫保護效果。

[1]陳果亮.規模化豬場豬瘟疫苗群體免疫程序的研究[D].長沙:湖南農業大學, 2013:69-70.

[2]Takahashi H，Takeshita T，Morein B,etal.Induction of CD8+ cytotoxic T cells by immunization with purified HIV-1 envelope protein in ISCOMs[J].Nature,1990,344:873-875.

[3]薛家賓,楊龍圣,徐為中，等.免疫日齡對兔病毒性出血癥抗體水平和保護率的影響[J].江蘇農業科學,2006,6:327-329.

[4]Johnston BA,Eisen H,Fry D.An evaluation of several adjuvant emulsion regimens for the production of polyclonal antisera in rabbits[J].Lab Anim Sci,1991,41:15-21.

[5]劉衛濤,柳 洲,李育合，等.新佐劑Montanide ISA 50V2在馬免疫中的應用研究[J].微生物學免疫學進展,2013,41(4):42-44.

[6]顧一峰,張新民,馬宇瀅，等.不同免疫次數對大鼠血清總IgE和特異性IgE的影響[J].上海實驗動物科學,2004,24(4): 234-239.

2017-02-20

S852.4

A

1005-7307(2017)03-0006-004