有氧運動對Ⅱ型糖尿病大鼠沉默信息調節因子表達的干預研究

李祖建?李偉

摘要：隨著Ⅱ型糖尿病發病率的逐年升高，尋找安全且可長期使用的治療手段已成為醫學界研究的熱點。已有的研究表明運動干預可明顯改善胰島素抵抗，但關于其具體的分子機制尚不清楚。證據表明SIRT1表達下降或活性改變可能與胰島素抵抗相關性疾病的發病相關。通過研究，證實不同運動干預方案對SIRT1在Ⅱ型糖尿病大鼠腎臟中表達的影響，明確SIRT1在胰島素抵抗中的作用。

關鍵詞：有氧運動；Ⅱ型糖尿病；沉默信息調節因子

Ⅱ型糖尿病所引起的各種并發癥，已經成為致死、致殘并造成醫療費用增高的一個主要原因[1]。自上個世紀以來，適當合理的運動對糖尿病的預防和控制作用已得到了學術界和大眾的認可。近年來，沉默信息調節因子1（SIRT1）的功能在改善胰島素抵抗的作用中日益受到關注。越來越多的證據表明SIRT1 表達下降或其活性改變可能參與胰島素抵抗相關性疾病的發生發展。SIRT1在線粒體生物發生、脂肪代謝、抗氧化等一系列與胰島素抵抗產生相關的病理生理過程中起著至關重要的作用。運動在預防和控制胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病（T2DM）以及與糖尿病相關的合并癥中起重要作用[3]。本項目擬通過高糖高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導建立T2DM模型，探討T2DM大鼠腎臟SIRT1的表達和相關指標的變化。采用不同的運動強度對高脂飲食實驗大鼠進行運動訓練，研究合理的運動干預對T2DM大鼠腎臟SIRT1的表達的影響。

一、研究方法

（一）T2DM大鼠模型建立

造模組大鼠在高糖高脂飲食喂養4周后，左下腹腔注射STZ（30mg/kg，隔日1次，共2次）。健康對照組以普通飼料喂養4周后，注射等量檸檬酸緩沖液（30mg/kg，隔日1次，共2次）。注射藥物后間隔7天血糖測試儀檢測大鼠空腹血糖（測試前禁食12 h）即注射后血糖，以血糖含量16.7 mmol/L為Ⅱ型糖尿病大鼠模型判定標準。造模成功后繼續以普通飼料喂養，并定期測試每組大鼠血糖指標。

（二）T2DM大鼠實驗分組

造模成功的T2DM大鼠，隨機分為高脂飲食組（HFD組）、高脂飲食后低強度運動組（HFD-LE組）、高脂飲食后中等強度運動組（HFD-ME組），高脂飲食后高強度運動組（HFD-HE組）。同時，普通飼料大鼠作為正常飲食健康對照組（H）。

（三）運動干預方案的實施

參照相關文獻的大鼠游泳運動方法，采用無負重耐力游泳運動方案，游泳水溫（30±2）℃，水深50cm，每只大鼠有200cm2的活動面積以保證其持續活動。高脂飲食后低強度運動組（HFD-LE組，10只）每天游泳30min，高脂飲食后中等強度運動組（HFD-ME組，10只）每天游泳60min，高脂飲食后高強度運動組（HFD-HE組，10只）每天游泳90min，每周游泳6d，共持續6周。

（四）血樣及組織標本采集

實驗結束各組大鼠禁食12h（自由飲水），用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，固定，解剖。心尖取血于抗凝管中，3000r/min離心15min，分離血漿后置于-70℃冰箱冷凍保存。迅速取出大鼠腎臟標本于冰袋上，剝離表面脂肪組織，置于-70℃冰箱保存，待作組織勻漿檢測。

（五）指標測試

1.比色法定量檢測SIRT1活性

50mg組織加入0.5mLPBS中勻漿并置于10mlL的EP管，隨后加入1ml裂解液。強力渦旋震蕩10s后置于冰槽里孵育15min，隨后加入4ml預冷的分離液中混勻。放入4℃臺式離心機離心1300RPM，10min。小心抽去上清液置于10 ml的EP管中并加入4mL預冷的清理液，然后放入4℃臺式離心機離心1300 RPM，10min。小心抽去1mL上清液到新的預冷的1.5mL離心管。小心加入 100?L預冷的萃取液并混勻。加入10%Triton 10?L，使終濃度為1%，震蕩 30s 至1min。置于冰槽里孵育30min后放入4℃臺式離心機離心16000 RPM，10min。小心移取上清液到新的預冷的1.5ml離心管。移取10?L進行蛋白定量檢測，其余用作活性測定。開啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長405nm，并置零；輕輕搖動96孔酶標板30s，放進30℃培養箱里，孵育60min，避免光照。輕輕搖動96孔酶標板30s，放進30℃培養箱里，孵育30min，即刻放入酶標儀檢測。

計算公式：SIRT1 活性（U/mg）=（樣品讀數-背景讀數）×0.1（mL）× 樣品稀釋倍數/0.02（mL）/10.5（吸光系數）/1（反應時間）/0.6（光徑距離：cm）；

2. real-time PCR檢測組織中SIRT1 mRNA的表達

以Trizol液提取腎臟組織的總RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。應用Primer5.0軟件設計引物，SIRT1引物：正義鏈5?-AAACTTTTGCTGTAA CCCTG-3?，反義鏈5?-CAAGCCGCCTA CTAATCT-3?。以GAPDH作為內參照，其引物正義鏈5?-GCACCGTCAAGGCT GAGAAC-3?，反義鏈5?-ATGGTGGTG AAGACGCCAGT-3?。引物濃度為200nmol/L，反應體系25?L，反應試劑為SYBR Green PCR Master Mix。

3.Western blot檢測組織中SIRT1蛋白的表達

收集待測組織，4℃離心5min，向沉淀中加入50?LRIPA裂解液，于冰水浴中裂解30min，4℃、12000r/min離心10min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入鼠抗SIRT1抗體（1：100）、鼠抗B-actin抗體（1：1000）4℃過夜。TBST（pH=7.5，含10mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.1%Tween-20）漂洗4次，10 min/次。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗4次。電化學發光顯影，采用美國UVP公司的GelDot-It300全自動化學發光凝膠成像系統進行分析。

（六）數理統計

采用SPSS23.0進行分析，計量資料以X±S，P<0.05表示有顯著性差異。

二、研究結果

通過各實驗組腎臟組織SIRT1活性的比較發現，與H組相比，HFD組SIRT1活性無顯著變化（P>0.05），HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE組SIRT1活性顯著升高（P<0.05），但HFD-LE、HFD-ME和HFD-HE之間無顯著性差異（P>0.05）。（見表1）

三、研究結論

該研究證實，不同運動干預方案對SIRT1在T2DM腎臟中表達的影響，確定SIRT1在胰島素抵抗中的作用。有研究證實，運動的這種腎臟保護功能可能與其能夠增加SIRT1的表達有關。運動干預可能通過增加SIRT1的表達，減少p38和p53的表達，從而改善糖尿病腎病氧化應激狀態，保護腎功能。進一步提示增加SIRT1的表達可能有助于糖尿病。在脲鏈菌素誘導的糖尿病腎病大鼠模型中發現，運動干預能減少丙二醛的產生，增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，改善其氧化應激狀態，同時亦能減輕蛋白尿，延緩肌酐清除率的下降，從而改善腎功能。[3]高脂飲食是誘導肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要環境因素。糖尿病以血糖升高及代謝紊亂為其特征。糖尿病腎病目前已成為終末期腎臟病最主要的病因之一。研究表明SIRT1可能參與了糖尿病腎病的發生與發展。

參考文獻：

[1]Pagel-Langenickel I，Bao J，Pang L，et al.The role of mitochondria in the pathophysiology of skeletal muscle insulin resistance[J].Endocr Rev，2010，31：25-51.

[2]張好好.SIRT1 在改善高脂飲食誘導的胰島素抵抗模型中的作用及其機制研究[D].武漢：華中科技大學同濟醫學院，2012.

[3]趙軍，李方暉，付強.沉默信息調節因子2相關酶1與運動[J].中國老年學雜志，2011，31：906-910.

（作者單位：李祖建 贛南醫學院康復學院；李偉 福建師范大學體育科學學院 贛南醫學院康復學院）