辣椒病毒病病原種類檢測初報

陳靈芝，張茹，魏兵強，王蘭蘭

摘要：針對甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒組育苗棚、試驗地以及近郊辣椒種植田病毒病發病嚴重問題，開展了病毒病病原種類鑒定，并比較了雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（DAS-ELISA）和簡易試紙條對同一種病毒的檢測結果。結果檢測出了TMV、PVV和PVS 3種病毒，其中TMV為優勢種群，侵染率高達66.7%，未發現CMV侵染。試驗結果表明，DAS-ELISA法和簡易試紙條法對同一種病毒檢測結果基本一致。

關鍵詞：辣椒；病毒；檢測

中圖分類號：S436.418.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2017）11-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.11.006

A Preliminary Report on Detection of Pathogenic Species of

Virus Disease in Pepper

CHEN Lingzhi， ZHANG Ru， WEI Bingqiang， WANG Lanlan

（Institute of Vegetables， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：We use DAS-ELISA method to indentify the pathogenetic virus and compare the result between DAS-ELISA and immunostrip. The result detects three virus： TMV、 PVV、 PVS， and TMV is the prevalent pathogenic virus， the detection rate is 66.7%. TMV is the daninatnt species， CMV isnt detected. The detection results between DAS-ELISA and immunostrip is almost accordance.

Key words：Pepper；Virus；Identification

辣椒病毒病是近年來危害辣椒生產的重要病害。植株一旦被病毒病感染，常表現為葉片皺縮、斑駁、黃化、花葉、壞死、畸形和植株矮化，且發病率極高，傳播迅速，易造成嚴重減產，產量損失在20%～70%[1 ]。近幾年來辣椒病毒病由原來的次要病害逐漸上升為主要病害，危害逐年加重，嚴重影響了辣椒的產量、品質[2 - 3 ]。據報道，至少有45種病毒可侵染辣椒和甜椒，且多數國家以煙草花葉病毒（Tobacco mosaicvirus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）侵染最為普 遍[4 - 7 ]。在我國已鑒定出病毒種類有15種，多數地區以TMV及CMV為優勢種群。甘肅省近年來辣椒病毒病危害日趨嚴重，已逐漸上升為辣椒生產上的主要病害，對病毒病進行準確的診治是有效防控的前提。從2014年至今，我們在甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒組育苗棚、試驗地以及近郊辣椒種植地均發現辣椒幼苗和成株疑似侵染病毒病，主要癥狀表現為幼苗從第1片真葉畸形，葉片皺縮、黃化，個別植株生長點壞死。此后，隨著幼苗生長及定植，癥狀有所緩解，在9、10月份，辣椒采收后期，葉片皺縮、黃化、畸形癥狀加重。在甘肅省辣椒主產區白銀、武威等地調研中也發現辣椒生產中有此類癥狀出現。

我們通過調查甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗地、近郊辣椒種植地病毒病發病情況，采集病樣，針對CMV、TMV、PVX、PVY、PVV、PVS、PVM、PVA等8種病毒，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（DAS-ELISA）、簡易試紙條進行檢測和鑒定，以明確辣椒病毒病的種類及優勢種群，為病害的診斷、抗病育種和綜合防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2015 — 2016年在甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗地和近郊辣椒種植地調查病毒病發生情況，并采集疑似病毒樣品77份。樣品保存于4 ℃冰箱中。

2015年3月在育苗棚采集病樣25份，2016年3月和9月在育苗棚、試驗地、近郊辣椒種植地采集病樣47份，健康樣品5份，分別進行CMV、TMV、PVX、PVY、PVV、PVS、PVM、PVA雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（DAS-ELISA）檢測和CMV、TMV簡易試紙條檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（DAS-ELISA）

用于DAS-ELISA檢測的抗體及陽性、陰性對照樣品為美國Agdia公司產品。取采集到的新鮮待測樣品按0.1 g/mL加入樣品抽提緩沖液中充分研磨，將樣品、陽性對照及陰性對照分別加入到酶聯板反應孔中，室溫條件下于黑暗潮濕環境中孵育2 h。具體檢測步驟參照產品說明書。

1.2.2 CMV、TMV簡易試紙條檢測 購自北京中檢葆泰生物技術有限公司代理的美國Agdia產品。抽取2016年3、9月份在甘肅省農業科學院蔬菜研究所育苗棚、試驗地采集的16份中的11份，其中9份為病樣，2份無病癥的樣品作為陰性對照。具體檢測步驟參照產品說明書。

2 結果與分析

2.1 癥狀表現

在甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗田、近郊辣椒種植地調查發現，辣椒病毒病普遍發生。苗期發病時期可提前至第1片真葉，表現為葉片上卷、畸形。隨著苗齡的增大，癥狀有所緩解，植株4～5層新葉表現為健康。幼苗定植后，隨著抗性的提高及采用防控措施，病毒病病情進一步得到緩解。在采收后期，伴隨蟲害，病毒病發病嚴重，癥狀也復雜多樣，諸如明脈、斑駁、花葉、皺縮、畸形、黃化、壞死和矮化等。

2.2 雙抗體夾心酶聯免疫吸附（CMV、TMV、PVX、PVY、PVV、PVS、PVM、PVA）法檢測

在采集到的辣椒病樣中檢出TMV、PVV和PVS 3種病毒，其中TMV的總檢出率為66.7%，PVV為33.3%，PVS為10%，沒有檢出CMV。TMV和PVV復合侵染的檢出率為16%，TMV、PVV和PVS復合侵染的檢出率為3.6%。表明甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚和近郊試驗地侵染辣椒的主要病毒為TMV，為優勢病毒種群。

2.3 簡易試紙條檢測

從表2看出，在TMV檢測中，列出的11份樣品中有9份病樣DAS-ELISA TMV酶標儀讀數均超過了陰性對照的2倍，且在酶標板上呈現出明顯的顯色反應，結果呈陽性。對9份病樣進行簡易試紙條檢測，結果均呈陽性，9份病樣DAS-ELISA檢測結果與簡易試紙條檢測的完全一致。2份健康樣品ⅠD7、m62 DAS-ELISA TMV酶標儀讀數分別為0.509、0.06，酶標板上分別呈陽性和陰性，而簡易試紙條檢測結果均呈陰性，2種檢測方法對ⅠD7的檢測結果不一致。在CMV檢測中，列出的11份樣品中，DAS-ELISA TMV酶標儀讀數均為零，在酶標板上呈無色反應，結果呈陰性；對11份樣品進行簡易試紙條檢測，結果均呈陰性，2種檢測方法檢測的結果完全一致。

以上結果表明，DAS-ELISA和簡易試紙條對同一種病毒檢測結果基本一致。但二者的檢測成本相差較大，據推算，進行DAS-ELISA檢測時，檢測1個樣本的成本為25元，而用簡易試紙條檢測時，檢測1個樣本的平均成本為40元。

3 小結與討論

對甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚和近郊試驗地病毒病病原種類進行了鑒定，其檢測出TMV、PVV和PVS 3種病毒，其中TMV為優勢種群，侵染率高達66.7%，與文朝慧等[8 ]檢測的甘肅省河西地區病毒優勢種群一致，但河西地區CMV侵染率為33.3%，而本試驗未發現CMV侵染。PVV 和 PVS是世界各地侵染馬鈴薯主要病毒之一，導致馬鈴薯種性退化、嚴重減產和品質降低，其侵染辣椒的報道較少。大多數病毒均可通過蚜蟲傳播，甘肅省近年來保護地蔬菜種植面積日益擴大，導致蚜蟲發生量增加，加上種苗的異地運輸等加速了植物病毒的傳播。

血清學方法是檢測病毒病病原的首選技術，檢測中使用最多的是DAS-ELISA。ELISA檢測的靈敏度較高，可檢測到濃度為0.1～10 ng/mL的病毒，而且檢測的通量大，但存在操作步驟繁瑣、耗費時間長等缺陷。利用簡易試紙條檢測病毒具有簡單、快捷的優點，1個樣品的檢測在5～6 min完成，適合田間即時檢測。本試驗比較了CMV和TMV DAS-ELISA法和簡易試紙條法的檢測結果，表明DAS-ELISA和簡易試紙條對同一種病毒檢測結果基本一致。以成本考慮，田間即時檢測應采用簡易試紙條法。

本試驗采集樣品有限，并且僅對8種病毒進行了檢測，有些表現病毒病癥狀的樣品還未確定毒原，樣品中是否還存在其它侵染辣椒的病毒種類如 ToMV、TSWV、和 PMMoV 等仍需進一步鑒定。

參考文獻：

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（本文責編：陳 珩）