水稻黃嘌呤脫氫酶基因OsXDH克隆及表達分析

摘要：【目的】克隆水稻黃嘌呤脫氫酶（Xanthine dehydrogenase，XDH）基因（OsXDH），分析其生物信息學特性及表達特性，為研究XDH在水稻生長發育和響應逆境脅迫中的調控機制提供理論依據。【方法】以粳稻品種日本晴為材料，采用同源克隆技術克隆OsXDH基因，應用生物信息學方法對其氨基酸序列進行分析。利用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測OsXD14基因的組織表達特性及逆境脅迫下的表達情況，并對不同轉基因株系乳熟期劍葉OsXDH基因表達量、XDH活性和葉綠素含量進行比較分析。【結果】克隆獲得OsXDH基因的開放閱讀框序列（ORF）（GenBankg登錄號LOC4333171），其長度為4110 bp，編碼1369個氨基酸。OsXDH蛋白分子量大小為150.23 kD，理論等電點（pI）為6.54，與小麥、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分別為84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%，表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性。OsXDH基因在水稻不同組織部位均有表達，灌漿期的表達量顯著高于苗期和分蘗盛期（P<0.05），且受干旱、黑暗、高溫和鹽脅迫誘導高效表達。OsXDH過表達水稻轉基因株系乳熟期劍葉的XDH活性和葉綠素含量高于野生型，OsXDH干擾轉基因株系的XDH活性和葉綠素含量低于野生型。【結論】OsXDH基因受水稻生長發育和逆境脅迫因子誘導表達，推測其是調控水稻生長發育和響應逆境脅迫的關鍵基因。

關鍵詞：水稻；OsXDH基因；基因克隆；生物信息學；表達分析；脅迫

中圖分類號：S511.03 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2113-09

0引言

【研究意義】由于生態環境不斷惡化，干旱、鹽堿、極端溫度及重金屬污染等嚴重影響糧食作物的產量和品質。作物抗性是由多基因控制的數量性狀，抗性基因克隆和功能分析已成為研究熱點。黃嘌呤脫氫酶（Xanthine dehvdrogenase，XDH）作為調控嘌呤代謝的中間酶類，能將黃嘌呤和次黃嘌呤催化生成尿酸，經一系列代謝反應，最終生成酰脲類物質（Ureides），在應答生物脅迫與非生物脅迫中發揮重要作用（Montalbini，2000；Aguey-Zinsou et al.，2003；Zdunek-zastocka and Lips，2003；Taylor and Cowan，2004；Zrenner et al.，2006；Brychkova et al.，2008a）。因此，克隆水稻XDH基因（OsXDH），分析其序列特征，可為闡明植物XDH的抗逆境脅迫調控機制提供理論參考。【前人研究進展】目前，已對不同植物XDH的抗逆境脅迫調控機制開展了大量研究，結果均表明XDH對逆境脅迫有應答響應，與植物體內的多個生理代謝相關（Aguey-Zinsou et al.，2003；Taylorand Cowan，2004；Nakagawa et al.，2007），如Montal-bini（1991）研究發現，感染銹病的豆科植物葉片中嘌呤分解代謝加快，酰脲類物質含量快速積累，對非共生病原的抗性增強。植物抗性增強的原因是嘌呤代謝產物酰脲類物質具有較高的碳氮比，易于在植物體內轉運，是氮素貯存和低耗轉運載體，可降低氮素轉運過程中的能量損耗，以提高植物在逆境脅迫下的生存能力（Buchanan-Wollaston，1997；Gepstein，2004），因此，植物體內的XDH活性隨著鹽和NH4濃度的增加而升高，且氨態氮處理下XDH活性高于硝態氮處理（Barabfis et al.，2000；Zrenner et al.，2006；Zdunek-zastocka and Lips，2003）。也有研究表明，酰脲類物質可清除植物體內H₂O₂、O₂等活性氧自由基（Becker et al.，1989；Pastori and del Rio，1997），增加尿囊素和尿囊酸含量，從而降低氧化性損傷和減少幼苗死亡（Brychkova et al.，2008b）。當植物受干旱、鹽脅迫和黑暗脅迫時，XDH活性升高，尿酸和酰脲類物質含量增加，體內活性氧含量降低，促使植株對環境脅迫的耐受能力增強，其病死率明顯降低（Brychkova et al.，2008b；Watanabe et al.，2010；Maet al.，2016；Hofinann，2016；You et al.，2017）。但鉬素缺失會阻礙黃嘌呤分解代謝，不利于氮素在植株體內的運輸，導致植株長勢變弱（孫學成和胡承孝，2005）。此外，有研究表明XDH蛋白結構的發生改變可介導細胞分裂素、脫落酸和生長素等植物激素的動態平衡，發揮對植物性狀及抗逆境脅迫的調控作用（Leydecker et al.，1995；Taylor and Cowan，2001；Smith and Atkins，2004；Watanabe et al.，2014）。【本研究切入點】至今鮮見有關水稻OsXDH基因克隆并分析其在非生物脅迫下表達特性的研究報道。【擬解決的關鍵問題】利用同源克隆技術克隆水稻OsXDH基因的開放閱讀框序列（ORF），采用生物信息學軟件分析其序列結構特征，并用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測其組織表達特性及逆境脅迫下的表達情況，同時比較不同OsXDH轉基因水稻株系乳熟期劍葉OsXDH基因表達量、XDH活性及葉綠素含量的差異，為研究XDH對水稻品種生長發育及響應逆境脅迫的調控機理提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試的粳稻品種為日本晴（Oryza sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare），其野生型、OsXDH干擾轉基因株系（Ri3、Ri5和Ri6）及過表達轉基因株系（OEl、OE3和OE9）均由江西省作物生理生態與遺傳育種重點實驗室提供。主要試劑：KOD FX高保真PCR酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，Mini-BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒、PrimeScript^TMRT Master Mix試劑盒和SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，其他生化試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要設備儀器：人工氣候箱（GXZ智能型，寧波江南儀器廠）、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統（BIO-RAD，美國）、NanoDrop ND2000超微量核酸蛋白分析儀（Thermo，美國）、CFX96 Real-Time PCR Detection System（B10-RAD，美國）、TU-1810紫外可見分光光度計（普析通用，北京）和電泳轉印系統（BIO-RAD，美國）。

1.2脅迫處理及樣品采集

干旱脅迫處理采用土培法，高溫、黑暗和鹽脅迫處理均采用水培法。所有處理均在人工氣候箱中進行，正常生長條件參數：12 h/12 h（白天/黑夜）、28℃/25℃（白天/黑夜）、光照強度為20000 lx/0 lX（白天/黑夜）和75%相對濕度。水稻幼苗在正常條件下生長N4.5葉期，選取長勢基本一致的植株進行脅迫處理。干旱脅迫處理：施用30%PEG-6000溶液進行模擬干旱脅迫處理，脅迫時間為4 d。高溫脅迫處理：處理期間將人工氣候箱溫度調至42℃/42℃（白天/黑夜），其他參數不變，脅迫時間為5 d。黑暗脅迫處理：處理期間將人工氣候箱光照調至0 lx/0 lX（白天/黑夜），其他參數不變，脅迫時間為6 d；鹽脅迫處理：在營養液中添加200 mmol/L NaCl，脅迫時間為3 d，脅迫處理后，更換為正常的水培營養液。每處理均在脅迫處理前、脅迫處理后及恢復生長7 d后采集主莖最上部完全展開葉，液氮速凍后，于80℃保存，用于不同逆境脅迫下OsXDH基因的表達特性分析。

將日本晴的野生型、OsXDHtz擾轉基因株系及過表達轉基因株系種植于江西農業大學實驗田，采集野生型苗期（4.5葉期）的葉（主莖最上部葉）、莖、根及分蘗盛期和灌漿期主莖最上部葉，液氮速凍后，于-80℃保存，用于qPCR檢測不同組織及不同生育期OsXDH～因的表達情況；采集野生型、OsXDH干擾轉基因株系及過表達轉基因株系乳熟期劍葉，液氮速凍后，于-80℃保存，用于OsXDH基因表達量、XDH活性和葉綠素含量測定。

1.3總RNA提取及cDNA第一鏈合成

按照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說明提取水稻葉片總RNA，利用NanoDrop ND2000超微量核酸蛋白分析儀對其濃度和質量進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以提取的總RNA為模板，按照PrimeScript^TM1^stStand cDNA Syn-thesis Kit說明反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.4引物設計及合成

根據擬南芥AtXDH1基因序列在NCBI數據庫中進行BLAST檢索，發現在水稻基因組數據庫中存在相似度較高的轉錄本（OSJNBa0091822.11），被詮釋為Xanthine dehydrogenase。根據NCBI數據庫中AtXDH1基因的cDNA序列，利用Primer 5.0設計引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5基因克隆

以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系50.0μL：2xPCR Buffer for KOD FX 25.0μL，2 mmol/LdNTPs 10.0μL，10μmol/L正、反向引物（ORF-F和ORF-R）各1.5μL，cDNA模板2.0μL，1.0 U/μL KODFX 1.0μL，ddH₂O補足N50.0μL。擴增程序：94℃預變性2.0 min；98℃10 s，58℃30 s，68℃5 min，進行35個循環；68℃延伸10.0 min，4℃保存。取10.0μL PCR產物用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6生物信息學分析

利用NCBI數據庫進行BLAST同源比對分析，利用ORF Finder尋找基因序列的編碼框，利用Prot-Param和Smart進行蛋白的理論性質和保守結構域預測，利用NetPhos 3.1 Server和DictyOGlvc 1.1 Server預測氨基酸序列磷酸化及O-糖基化修飾情況，利用ProtScale分析蛋白質的疏水性，利用SignalP1.1Server、TMHMM Sever 2.0和PSORT II預測蛋白的信號肽和亞細胞定位預測，運用SOPMA預測蛋白的二級結構，使用DNAMAN進行氨基酸序列比對及聚類分析。

1.7 qPCR檢測

利用SYBR*Premix Ex Taq^TMⅡ試劑盒在CFX96Real-Time PCR Detection System上進行qPCR檢測，內參基因為Ubq-real，其引物序列（Ubq-real-F和Ubq-real-R）見表1。反應體系25.0μL：SYBR Pre-mix Ex Taq Ⅱ 12.5μL，正、反向引物（qPCR-F和qPCR-R）各1.0μL，DNA模板（<100 ng）2.0μL，ddI-120補足至25.0μL。擴增程序：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，進行40個循環。利用Bio-Rad CFX Manager 2.1數據分析模塊分析OsXDH基因的表達豐度。

1.8 XDH活性測定

稱取0.2 g去除葉脈的水稻劍葉碎片，液氮研磨2～3次后加入800.0μL蛋白提取液研磨至糊狀；將研磨液移入2 mL離心管，4℃下14000 r/min離心20 min后取上清液，65℃水浴90 s變性，再離心取上清液；取10μL上清液放入5 mL離心管中，加入490.0μLddH₂O和4.5 mL考馬斯亮藍溶液混勻，于595 nm波長下測定OD值。利用牛血清蛋白制作標準曲線，測定可溶性蛋白含量，并進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為50 ug，時長為4 h，將膠片放至以次黃嘌呤為底物和以氮藍四唑為顯色劑的混合溶液中，暗處20 min，用冰醋酸清洗后成像（Sagiet al.，1998）。

1.9葉綠素含量測定

參照Lichtenthaler和Wellbuen（1983）的方法，用80%丙酮溶液提取水稻葉片葉綠素，并用分光光度法測定其含量。

1.10統計分析

試驗數據采用Excel 2007進行整理作圖；利用SPSS 22.0進行顯著性分析（One-way ANOVA）。

2結果與分析

2.1 OsXDH基因cDNA編碼區的克隆結果

以反轉錄合成的cDNA為模板，以CDS-F和CDS-R為引物，PCR擴增獲得目的片段。結果如圖1所示，目的片段約4500 bp，與預期結果相符。測序結果顯示，克隆獲得的OsXDH基因序列長度為4316bp，其開放閱讀框（ORF）長度為4110 bp，編碼1369個氨基酸（圖2）。將OsXDH基因序列提交至Gen-Bank，登錄號LOC4333171。OsXDH基因與基因組DNA序列的比對結果顯示，該基因含有14個外顯子和13個內含子。

2.2 0sXDH蛋白的生物信息學分析結果

2.2.1理化性質 OsXDH蛋白的理化性質預測結果顯示，其分子式為C6713H10509N182501976857，分子量為150.23 kD，理論等電點（pI）為6.54；丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸和纈氨酸個數分別占0sXDH蛋白氨基酸總數的8.0%、8.2%、8.6%和7.7%，不含蛋氨酸和含硒半胱氨酸；不穩定指數為38.87，表明其為穩定蛋白。

2.2.2保守結構域 OsXDH蛋白不僅存在1個CO_deh_flav_C結構域（455～561 aa），可與鉬結合形成鉬輔因子，構成XDH底物的結合部位和氧化還原部位，還存在1個進化保守的蛋白結構域Aid Xandh C（620～727 aa），此結構域僅存在于醛氧化酶和黃嘌呤脫氫酶中，由此推測黃嘌呤脫氫酶與醛氧化酶具有相似的功能，均可參與植物對非生物脅迫的響應。

2.2.3蛋白磷酸化和糖基化位點 氨基酸殘基的磷酸化和糖基化可調節蛋白的活性和功能。0sXDH蛋白氨基酸序列中發生磷酸化修飾的位點有131個，其中色氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化修飾位點分別有71、45和15個（圖3）；發生O-糖基化修飾的位點僅1個（圖4）。通過預測磷酸化與O-糖基化修飾位點，為黃嘌呤脫氫酶翻譯后修飾調控研究提供參考。

2.2.4信號肽及亞細胞定位 信號肽預測結果顯示，OsXDH蛋白信號肽平均值為0.106（<0.500），推測其為非分泌蛋白，在細胞質中合成后不被轉運。利用TargetP 1.1 Server預測發現OsXDH蛋白廣泛位于細胞內（除葉綠體和線粒體外），而pSORTⅡ預測其位于葉綠體中，存在明顯分歧，因此，其實際位置需利用免疫熒光、GFP融合表達等技術進一步確認。

2.2.5二級結構 OsXDH蛋白的二級結構中，無規則卷曲（Random coil，C）占35.43%，α-螺旋（α-he-liX，H）占31.56%，延伸鏈（Extended strand，E）占22.86%，β-轉角（β-turn，t）占10.15%。如圖5所示，4種二級結構分布較均勻。

2.2.6 親/疏水性 蛋白的親/疏水性有助于提高其穩定性及多樣性，與其結構和功能密切相關。由圖6可知，0sXDH蛋白疏水性最強的位點為第1314位，分值2.389；親水性最強的位點為第1029位，分值-3.589，親水性平均值為-0.098，由此推測0sXDH為親水性蛋白。

2.2.7同源比對及系統發育進化樹分析 從NCBI數據庫篩選獲得5種作物的XDH蛋白氨基酸序列，并與OsXDH蛋白的氨基酸序列進行比對，結果顯示OsXDH蛋白的氨基酸序列與高粱（Sorghum bico-lot）、谷子（Setaria italica）、小麥（Aegilops tauschii）、玉米（Zea mays）和油菜（Brassica napus）XDH氨基酸序列相似性分別為84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%（圖7）。系統發育進化樹分析結果表明，單子葉植物和雙子葉植物XDH蛋白同系物分別聚在兩個不同的分支，表明XDH蛋白在單子葉植物和雙子葉植物間存在一定的分化，但XDH蛋白在同種屬間保守性較高，如水稻與小麥、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、谷子和高粱同屬一個小分支，均為禾本科植物，XDH蛋白具有較高的同源性；雖然玉米同屬禾本科植物，但與蘆筍、油棕、芭蕉和蝴蝶蘭分屬于單子葉植物的另一分支群（圖8），其原因可能與物種起源地環境有關，玉米、蘆筍、油棕、芭蕉和蝴蝶蘭均起源于熱帶或亞熱帶地區。綜上所述，植物中XDH蛋白的氨基酸序列具有高度保守性，水稻OsXDH蛋白與小麥、二穗短柄草的XDH蛋白分子進化距離最小，親緣關系最近。

2.3 OsXDH基因表達特性分析結果

2.3.1 OsXDH基因組織表達特性 從圖9-A可知，苗期OsXDH基因在水稻根、莖和葉（主莖最上部葉）中的表達量無顯著差異（P<0.05，下同）。從圖9-B可知，苗期和分蘗盛期OsXDH基因在水稻主莖最上部葉片的表達量無顯著差異，但灌漿期OsXDH基因的表達量顯著高于苗期和分蘗盛期，由此推測OsXDH基因為特異性表達，參與水稻生長發育相關的分子調控。

2.3.2不同脅迫下OsXDH基因的表達情況 由圖10可知，不同脅迫處理均可誘導水稻OsXDH基因上調表達，其中干旱、黑暗和高溫脅迫處理后OsXDH基因的表達量均顯著高于脅迫處理前，恢復生長7 d后其表達量顯著降低，但仍顯著高于脅迫處理前，尤其是干旱和高溫脅迫處理后OsXDH基因的表達量增至脅迫處理前的2.5倍。鹽脅迫處理后OsXDH基因的表達量顯著高于脅迫處理前，恢復生長7 d后其表達量顯著降低，但與脅迫處理前無顯著差異。可見，OsXDH基因的表達受到逆境脅迫因子誘導高效表達，參與逆境脅迫響應。

2.4 OsXDH基因表達量對水稻乳熟期生理指標的影響

對野生型、OsXDH干擾轉基因株系及過表達轉基因株系乳熟期劍葉的OsXDH基因表達量、XDH活性和葉綠素含量進行比較分析，結果表明，OsXDH干擾轉基因株系的OsXDH基因表達量均顯著低于野生型和OsXDH過表達轉基因株系，OsXDH過表達轉基因株系的OsXDH基因表達量均顯著高于野生型（圖11-A）；OsXDH干擾轉基因株系XDH活性低于野生型，而OsXDH過表達轉基因株系高于野生型（圖11-B）；OsXDH干擾轉基因株系的葉綠素含量顯著低于野生型和OsXDH過表達轉基因株系，OsXDH過表達轉基因株系的葉綠素含量高于野生型，但未達顯著水平（圖11-C）。表明OsXDH基因表達量、XDH活性與葉綠素含量呈正相關，結合水稻不同生育時期OsXDH基因的表達特性，推測OsXDH基因參與調控水稻生育后期的生長發育。

3討論

本研究從粳稻品種日本晴中克隆獲得OsXDH基因ORF序列，長度為4110 bp，編碼1369個氨基酸。已有研究表明，擬南芥和蘭科植物的XDH基因均屬于核基因（Xiong et al.，2001；Hesberg et al.，2004；G6miak et al.，2010），但本研究中不同生物信息學軟件對OsXDH蛋白亞細胞定位結果不同，故未能明確其位置，需利用免疫熒光、GFP融合表達等技術進行蛋白亞細胞定位。此外，本研究通過同源比對及聚類分析，發現水稻OsXDH蛋白的氨基酸序列與單子葉作物高粱、小米和小麥的同源性較高，均在80.00%以上，雖然單子葉與雙子葉植物分屬不同分支，但其同源性仍在70.00%以上，證明不同植物中XDH蛋白的氨基酸序列具有高度的保守性，推測其在不同植物中發揮相似的生理功能。

本研究發現OsXDH基因在不同組織及不同生育期均有表達，但其在水稻灌漿期的表達量顯著高于苗期和分蘗盛期，表明OsXDH基因為特異性表達。同時本研究發現，在干旱、黑暗、高溫和鹽脅迫下，OsXDH基因表達量顯著上調，尤其在干旱和高溫脅迫下其增至脅迫處理前的2.5倍，推測水稻OsX-DH基因參與逆境脅迫響應。這與Hesberg等（2004）研究發現擬南芥中AtXDH1基因受不同逆境脅迫因子誘導均表達上調的結論一致。說明不同植物中的XDH基因具有相似表達調控功能。

本研究利用OsXDH干擾轉基因株系和過表達轉基因株系，對OsXDH基因的功能進行初步鑒定，結果顯示，OsXDH干擾轉基因株系中的XDH活性和葉綠素含量低于野生型，而OsXDH過表達轉基因株系的XDH活性和葉綠素含量均高于野生型，表明通過調控OsXDH基因的表達水平可調節水稻XDH活性，從而調控水稻的生長發育，與前人在擬南芥中的研究結果（Nakagawa et al.，2007；Watanabe et al.，2010；Zarepour et al.，2010；Watanabe et al.，2014）一致。由此推測OsXDH基因參與調控水稻生育后期的生長發育。在今后的研究中，可利用OsXDH～-擾轉基因株系和過表達轉基因株系進一步研究OsX-DH基因水稻在生長發育及逆境脅迫應答過程中的調控機制。

4結論

OsXDH基因受水稻生長發育和逆境脅迫因子誘導表達，推測其是調控水稻生長發育和響應逆境脅迫的關鍵基因。