椰子萌發過程中吸器內含物的變化規律

李靜　王仁才　楊耀東　吳翼　范海闊　弓淑芳

摘要：【目的】探討椰子萌芽過程中吸器內含物的變化規律，為提高椰子種果發芽率及促進椰子產業可持續發展提供參考依據。【方法】統計新鮮成熟的本地高種和紅矮椰子吸器發育過程中椰果的果實重量、縱橫徑、水含量、椰肉厚度及吸器重量和縱橫徑，使用紫外分光光度計測定，并分析本地高種椰子吸器萌發過程中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及可溶性蛋白和多酚含量等各組變化情況。【結果】椰果內的液態胚乳隨著椰子吸器發育過程中體積與重量的增大逐漸減少直至完全被吸收，白色硬質狀椰肉逐漸被吸收軟化且變褐色；多酚和可溶性蛋白含量逐漸減少，SOD和POD活性呈先上升后下降的變化趨勢；內含物間具有密切的相關性，其中，多酚含量與SOD活性呈顯著負相關（P<0.05，下同），與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關（P<0.01）；POD活性與可溶性蛋白含量呈顯著負相關，與SOD活性呈顯著正相關。【結論】新鮮成熟椰果的吸器在發育過程中具有較高的SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量，用作繁殖材料可獲得較佳的育苗效果。

關鍵詞：椰子；吸器；萌發；SOD活性；POD活性；多酚含量

中圖分類號：S667.4 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2163-06

0引言

【研究意義】椰子（Cocos nucifera L.）是棕櫚科椰子屬多年生喬木，其果實是營養豐富的天然有機食品，具有極高的經濟價值（Xu et al.，2007；Marinaet al.，2009），培育優良椰子品種和優良種苗，是發展椰子種植業的重要前提和保證。我國椰子產業發展目前存在品種單一、產量較低、病蟲害較多和樹體老化（Cordova et al.，2003）及颶風和海嘯等逆境危害的問題（Samosir and Adkins，2014），導致椰子供需矛盾突出。椰子主要以種子進行繁殖，商業化制種程序繁瑣、種子萌發周期長且萌芽率低（僅40%）、生產成本較高。椰子吸器（Haustorium）是其種子萌發的特殊產物，是椰果逐漸膨大過程中充滿整個椰腔的海綿狀吸收器官，可分泌脂肪酶、纖維素酶和蛋白酶等將椰子果實的脂肪和蛋白質轉化為可溶性養分，通過維管系統供給椰子苗生長，對椰子種子萌發起著重要作用（陳良秋和萬玲，2007），但目前有關椰子吸器的形成機理及其對椰子種子萌發所起作用了解甚少。因此，探討椰子萌芽過程中吸器發育及內含物的變化規律，對培育優質椰子種苗及促進椰子產業發展具有重要意義。【前人研究進展】植物胚性細胞發育過程中各種生理生化反應均有大量特異性酶如過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）合成并參與代謝。詹園鳳等（2006）研究發現，大蒜體細胞胚胎發生過程的SOD和POD活性變化與胚性愈傷組織誘導及體胚發育密切相關，POD對體胚的誘導起主導作用，SOD在體胚發育和成熟中起主導作用。林玉玲和賴鐘雄（2007）對紅核子龍眼胚胎發育過程中的SOD活性進行測定，結果表明，在龍眼子葉形胚發育早期，SOD活性迅速升高，之后上升較平緩。董姝娟和郭修武（2008）研究發現，金星葡萄胚胎發育過程中SOD、POD活性呈增高趨勢，可能與其無核敗育有關。陳義挺等（2009）研究發現，隨著龍眼胚性細胞的分化，POD活性總體呈下降趨勢。除酶活性變化外，組織內含物的變化也是體胚發育的重要指標。可溶性蛋白是種子中重要的滲透調節物質和營養物質，對細胞的生命物質及生物膜起保護作用。植物在逆境條件下可通過增加可溶性蛋白的合成，直接參與其適應逆境過程（張明生等，2003）。多酚類物質是植物種子中重要的內含物，普遍具有抗菌、抗氧化及抗癌等生物活性，且已被證實有利于植物生長（Randhk and Shetty，2003），多酚的存在是導致植物組培褐變的主要因素（張振霞和洪萍，2010），研究其在種子中含量的變化規律有助于有效減少胚培養過程中的褐變現象。Manivannana等（2016）研究表明，干燥椰子吸器的主要成分為可溶性糖、淀粉、不溶性膳食纖維、可溶性膳食纖維、蛋白質、脂肪、灰分和微量酚類。Konan等（2017）對室溫存儲1個月后的馬來西亞黃矮（MYD）椰子在苗圃催芽，并對萌芽2和4個月的椰子吸器進行生化分析，結果表明，其油含量從12.90%）2升N37.30%，而可溶性糖主要為蔗糖、果糖和葡萄糖。【本研究切入點】吸器是椰子種苗繁育的重要組織，其發育過程中內含物的變化直接影響發芽率，但目前針對椰子吸器萌發過程中SOD和POD活性及可溶性蛋白和多酚含量等內含物變化的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】在統計不同椰子品種不同季節種果發芽率的基礎上，探討本地高種椰子吸器萌發過程中SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量的變化規律，找出提高其種果發芽率的突破口，為椰子產業健康發展提供參考依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試椰子品種為本地高種和紅矮，以未發育（T0）及發育到椰腔1/8（T1）、1/4（T2）、1/2（T3）、充滿整個椰腔但椰苗較小（高度小于50 cm）（T4）和充滿整個椰腔且椰苗發育粗壯（苗高達1 m）（T5）椰苗的椰子吸器為試驗材料（圖1）。椰子果實于2016年在中國熱帶農業科學院椰子研究所育苗基地進行沙培。

主要試劑：福林酚（>99.0%）購自阿拉丁上海晶純生化科技股份有限公司；沒食子酸（>99.0%）購自麥克林上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均購自廣州化學試劑廠；SOD、POD活性和可溶性蛋白含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。主要儀器設備：KQ-500DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、離心機（Eppendorf 5801R型，德國艾本德公司）、紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2椰子發芽試驗及不同發育時期基礎數據統計

選取成熟的本地高種和紅矮椰果分批進行沙培，定期澆水，統計椰子出芽率。對不同發育期本地高種椰果（因每個發育期采樣均需3次重復，而紅矮發芽后椰子總數偏少，故后續研究均以本地高種椰子為試材）測定其果實重量和縱橫徑后剖開果實分別測定水含量、椰肉厚度、吸器重量及縱橫徑。

1.3多酚含量測定

1.3.1多酚提取 準確稱取各發育期本地高種椰子吸器2.0 g，加/k5.0 mL 80%乙醇用研缽研磨，充分勻漿，小心轉移至15.0 mL離心管中，殘渣用5.0mL提取液再研磨一遍充分洗滌后合并至15.0 mL離心管中；密封后40℃水浴，超聲波提取50 min（期間可振蕩混勻2～3次），室溫條件下4000 r/min離心10min；取0.5 mL上清液置于10.0 mL離心管中，依次加入2.5 mL 10%福林酚反應5 min后加入2.0 mL 7.5%Na₂CO₃，室溫下暗處反應40 min，用紫外可見分光光度計在波長765 nm處測定吸光值。

1.3.2標準曲線制備 取沒食子酸（100μg/mL）0、50、100、200、300和500μL分別用蒸餾水補足體積N500 μL，然后依次加入2.5 mL 10%福林酚反應5min后，再加入2.0 mL 7.5%Na₂CO₃，室溫下暗反應40 min，用紫外可見分光光度計在波長765 nm處測定吸光值，得到標準曲線y=0.0102x+0.03（R²=0.9979）。

1.3.3多酚含量計算 按照等量沒食子酸計算本地高種吸器的多酚含量。

1.4 SOD和POD活性測定

分別稱取各發育期本地高種吸器1.0 g用0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.1）按重量（g）：體積（mL）=1：9提取SOD和POD，冰浴條件下制成10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min后取20μL上清液按照操作說明測定SOD活性，取100 μL上清液按照操作說明測定POD活性。

1.5可溶性蛋白含量測定

取各發育期本地高種吸器1.0 g用5%生理鹽水按重量（g）：體積（mL）=1：9提取可溶性蛋白，冰浴條件下制成10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min后取50μL上清液按照操作說明測定可溶性蛋白含量。

1.6統計分析

試驗數據采用SAS 9.1進行方差分析和相關性分析。

2結果與分析

2.1不同發芽時期本地高種和紅矮椰子的出芽情況

由表1可看出，本地高種椰子春（3月）、夏（6月）和秋季（10月）的發芽率分別為51.0%、33.0%和58.8%，平均為47.6%，紅矮椰子在夏季（8月）和秋季（10月）的發芽率分別為27.2%和43.8%，平均為35.5%。說明炎熱夏季（6～8月）椰果的出芽率明顯低于春季（3月）和秋季（10月），生產上應選擇成熟、無凍傷及響水聲較大的新鮮成熟老果在天氣涼爽時進行育苗。

2.2本地高種吸器發育過程中椰果各部位的變化情況

由表2可看出，在本地高種吸器發育過程中椰果各部位的變化差異明顯，其中，吸器的縱橫徑在T0期分別為1.2和0.8 cm，T5期分別發育生長至10.2和9.8 cm；吸器重量在T0期為0.26 g，T4期發育至287.20 g；苗長在T0期為0，T5期發育生長至104.0cm；椰果內的椰子水含量從T0期的350 mL逐漸下降，至T5期被完全吸收；椰肉由T0期的硬質狀、厚1.5 cm變為T5期的柔軟黏稠狀、厚0.5 cm。吸器所占整個椰果的比重也在逐漸增加，由T0期的0.015%增加到T4期的13.611%，但在椰苗生長至T5期時吸器所占比重下降到8.000%，推測為吸器中的養分逐漸供給椰苗生長而導致其比重下降。

2.3本地高種椰子吸器SOD和POD活性的變化情況

從圖2可看出，本地高種椰子吸器的POD和SOD活性均呈先上升后下降的變化趨勢，POD活性在吸器發育至T4期時達最大值，隨后下降。吸器各發育時期的POD活性排序為T4>T5>T3>T2>TI>T0，SOD活性排序為T3>T4>T5>T2>T1>T0；方差分析結果表明，吸器各發育時期的POD活性間、SOD活性間差異顯著（P<0.05，下同）。說明SOD和POD活性對椰子吸器發育初期逐漸增大起主導作用。

2.4本地高種椰子吸器可溶性蛋白含量的變化情況

從圖3可看出，在椰子吸器發育過程中可溶性蛋白含量逐漸下降，由T0期的0.34 g/L下降至T5期的0.12 g/L，且各發育期間差異顯著。說明椰子吸器發育過程對可溶性蛋白的消耗明顯，為幼苗發育提供了充足的能量。

2.5本地高種椰子吸器多酚含量的變化情況

從圖4可看出，椰子吸器的多酚含量隨其發育進程呈先下降后略有上升的變化趨勢，由410.00μg/g逐漸下降至185.29μg/g；T0與T1時期的多酚含量差異不顯著（P>0.05，下同），T1與T2時期、T2與T3時期、T3與T4時期及T4與T5時期的多酚含量差異顯著。多酚含量在吸器發育初期較高，隨后下降，說明多酚參與了椰子吸器的發育過程，可促進吸器變大和椰苗變高。

2.6本地高種椰子吸器各組分間的相關性分析結果

對椰子吸器的多酚含量、POD和SOD活性及可溶性蛋白含量進行相關性分析，結果（表3）表明，多酚含量與SOD活性呈顯著負相關，相關系數為-0.83，多酚含量與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關（P<0.01），相關系數為0.94；POD活性與可溶性蛋白含量呈顯著負相關，相關系數為-0.82；SOD活性與可溶性蛋白含量的相關系數為-0.78，相關性不顯著；POD活性與SOD活性呈顯著正相關，相關系數為0.47。說明在椰子吸器發育過程中內含物的變化總體上相輔相成，互相利用。

3討論

目前采用組培技術生產椰苗尚屬世界性難題，椰子種苗繁育只能以成熟椰果為種源，育苗成活率低，周期長，且易受不同品種及不同成熟期影響，因此選擇較合適的椰果進行育苗才能節省椰果和提高育苗成活率。吸器作為椰子胚發育的關鍵器官，研究其內含物變化有助于理清椰子胚發育機理和確定吸器作為食品的一些評判指標。林玉玲和賴鐘雄（2007）研究發現，SOD可清除活性氧，促進龍眼體細胞胚的發生；Lin和Lai（2010）研究認為，SOD在體細胞胚發生分裂的早期起關鍵作用。本研究中，椰子吸器發育過程中SOD和POD活性均較高，可促進椰子吸器發育，對椰子種苗繁育起重要作用；多酚含量最高為410.00 μg/g，高于李一偉等（2012）對萍婆胚測定的多酚含量，表明多酚不僅在椰子發育中發揮重要作用，其含量還可作為高酚含量水果開發利用的參考指標。

吸器的多酚含量、POD和SOD活性及可溶性蛋白含量問有較密切的相關性，多酚含量與SOD活性呈顯著負相關，與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關，對應的相關系數分別為-0.84和0.94；POD和SOD活性與可溶性蛋白含量呈負相關，表明這些活性物質問相輔相成，在椰子吸器發育過程中起相互促進作用。Chikku和Raiamohan（2012）研究發現，椰子吸器水提取物對大鼠心肌梗死有顯著的保護作用和抗氧化性能，本研究中吸器的多酚含量、SOD和POD活性較高，其抗氧化功能也較強，具有作為椰果另一個可食部分開發利用的潛力，但需進一步對吸器的其他營養成分進行檢測，才能更完整地評價其食用價值（Manivannan et al.，2016）。

4結論

新鮮成熟椰果的吸器在發育過程中具有較高的SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量，用作繁殖材料可獲得較佳的育苗效果。