群體感應抑制及其植物病害防控應用研究進展

周靜煌　嚴準　高春生　余永廷　李智敏　曾糧斌　陳佳　郭利桃　嚴理　程毅

摘要：許多植物病原菌致病機制依賴于病原微生物群體感應系統的調控，基于群體感應抑制的原理篩選高效的群體感應抑制劑有望成為解決植物病害防治問題的有效途徑。文章介紹了群體感應抑制的研究策略，主要包括阻斷群體感應信號分子的產生、促進信號分子降解及抑制信號分子與受體結合；綜述了近年來主要的群體抑制劑種類及其在植物病害防治上的應用情況，指出群體感應抑制劑并不妨礙病原菌的正常生長代謝，而是抑制群體感應系統，減弱病原菌的毒力，降低其致病性。提出今后應加強群體感應抑制劑篩選和基于群體感應系統淬滅機制的植物病害防治研究，為植物病害防治提供綠色安全的防控措施。

關鍵詞：植物病害防治；群體感應；信號分子；群體感應抑制劑

中圖分類號：S432 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2197-07

0引言

植物病害防治一直備受關注，一些新的防治方法也不斷出現，目前最主要的防治方法包括植物進出口檢疫、抗病品種培育、農業栽培控制、化學藥劑防治、生物防治和生防機理治療等。生產上最常用的方法是化學防治，該法強調徹底滅殺病原物，然而，由于化學藥劑的長期大量使用，導致很多病原菌產生了耐藥性（Roy et al.，2011），對今后的植物病害防治是巨大挑戰，因此，研究更安全的病害防治策略尤為必要。許多植物病原菌致病性的形成受到群體感應（Quorum sensing，QS）系統的影響，致病菌定殖到宿主體內后，在Qs機制調控下激活與致病相關基因的表達而產生各種毒力因子，導致宿主發病（程古月等，2012）。此外，由于QS調節，病原菌侵染宿主后能形成生物被膜抵抗宿主的免疫，并產生對藥劑的抗性。因此，微生物QS系統的調控通路有望成為病害防治的新靶點（韋柯，2007）。

Fuqua等（1994）發現許多微生物的生理生化特征會隨著群體密度增加而發生改變，能夠分泌毒素、形成生物膜、產生抗生素、生成孢子、發射熒光等，以適應環境的變化，是微生物QS系統的自我調節（程古月等，2012）。在特定環境下，微生物產生并向環境中釋放一種被稱為自體誘導物（Auto-inducer，AI）的細胞外信號分子，隨著個體密度的增大，信號分子也會成比例增加，當信號分子積累到一定濃度時，會誘導微生物產生獨特的、多樣的群體行為，這一現象稱為QS（韋柯，2007）。微生物Qs所分泌的信號分子有3種，故將OS系統分為3類（圖1）：（a）革蘭氏陰性菌的酰基高絲氨酸內酯（N-acvl-homoserine lac-tones，AHLs）型系統。LuxI是可催化合成AI的胞內蛋白酶，其催化帶有酰基載體蛋白的酰基側鏈與S-腺苷蛋氨酸上的高絲氨酸結合成?；呓z氨酸內酯化合物（Acyl-homoserine lactone，AHL）。（b）自體誘導肽（Auto-inducter peptide，AIPs）系統，存在于革蘭氏陽性菌中。AIP是一種寡肽，雖是小分子多肽，但需經過ABC運轉系統（ATP-binding-cassette）或其他膜蛋白通道作用才能穿過細胞壁并行使功能（韋柯，2007）。（c）自誘導物Ⅱ類分子（AI-2s）系統。AI-2是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共有的信號分子，是調節細菌行為通用語言。AI-2的產生依賴于LuxS蛋白（Bassler et al.，1993），如失活LuxS基因則不產生AI-2（XavierK and Bassler，2003）。因此，可從植物病原微生物Qs的信號分子著手，減少由QS機制調節的致病性的產生，達到防治植物病害的效果。篩選高效的群體感應抑制劑（Quorum sensing inhibi-tors，QSIs）有望成為防治植物病害的一條有效途徑。

正是由于病原菌QS能調節其致病性的產生，作為一種新型的病害防治策略，QS調控系統越來越受到國內外學者重視。近年來，國內外對QSIs的研究發展迅速，并取得了一些進展。了解并有效地利用QS機制來控制病原菌生物膜的形成、毒力因子的產生、致病基因的表達、病原菌問相互抑制或競爭（梁新焱和阮海華，2015）等無疑為抵御病菌感染、植物病害和細菌耐藥性研究提供了一條新途徑。目前，AHLs降解酶已開始廣泛應用于植物病害防治上；同時，已有研究表明抗生素的使用可有效鈍化抑制QS系統，從而達到緩解軟腐病發生的作用（葛瑋珍，2013）。隨著上述研究的深入，傳統化學藥劑防治植物病害的瓶頸將有望被打破。

1 QS抑制的主要策略

基于上述QS調控原理，干擾病原微生物的QS系統的途徑有3種。WAHL系統為例，包括：（1）合成信號分子AHL底物的類似物來阻斷信號分子的形成；（2）促進AHL的降解；（3）抑制AHL與受體結合。

1.1阻斷信號分子產生

AHL的生物合成通常涉及一系列使用S-腺苷蛋氨酸（S-Adenosyl methionine，SAM）作為氨基供體生成高絲氨酸內酯環的一部分反應（Miller and Bassler，2001），?；d體蛋白（Acyl cartier protein，ACP）作為前體n-AHL的側鏈分子?；谝陨现R，合成了SAM類似物如丁酰-S腺苷甲硫氨酸、全?；d體蛋白、西尼毒素和L/D-S-腺苷高半胱氨酸等，研究顯示這些物質具有抗Os的活性（Scutera et al.，2014）。但目前僅在人體醫學上有應用，極少有進行植物病害防治的報道。

1.2阻止信號分子與受體蛋白結合

通過拮抗劑分子抑制信號分子的接收是另一個防控QS介導的植物病害機制，這些拮抗劑分子與信號分子競爭，干擾信號分子與受體結合。二酮哌嗪（Diketopiperazine，DKP）作為AHL類似物可與受體蛋白結合，從而阻止信號分子與受體蛋白結合，抑制QS系統所調節的基因的表達，使病原菌的致病性降低（Kalia and Purohit，2011）。由海洋紅藻分泌的鹵化呋喃也是與信號分子競爭并降解受體蛋白的AHL信號分子類似物，鹵化呋喃能有效抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）致病因子的表達，降低其對寄主的侵染能力（Hentzer et al.，2003）。

1.3信號分子的降解

在QS機制中AHL分子達到特定濃度是引發病原菌表達致病因子的關鍵。因此，如果能降解AHLs，使其無法達到濃度閾值，將很大程度削弱植物病原菌的致病性。雖然不同AHLs具有不同碳鏈長度和不同的?；鶄孺?，但均以高絲氨酸為主體（韋柯，2007），具有相似的調控基因表達的機制。根據AHLs的結構特點，理論上有4個作用位點可分解AHLs，分別是內酯酶（AHL-lactonase）位點、脫氫酶（AHL-decarboxvlase）位點、?；D移酶（AHL-acyl-ase）位點和脫氨酶（AHL-deaminase）位點（張麗群等，2010）。目前已在大量原核生物和少數真核生物中發現QS信號分子的降解酶。研究表明，群體猝滅（Quorum quenching，QQ）酶水解AHL中酰胺鍵或內酯環中的任何一個。降解AHLs很大程度上受AHL?；D移酶和AHL內酯酶等的調節（Lin et al.，2003）。在病原菌或寄主植物中表達AHL降解酶可破壞病原菌的QS系統，從而達到防治植物病害的效果。

1.4基于QS的植物病害防治策略

根據植物對病原菌QS系統的反應，可采用以下幾種策略防治由病原菌QS造成的植物病害。（1）植物本身能夠合成QSIs從而降低病原菌的侵染力。如從弗吉尼亞櫟的葉子和假紫斑大戟氣生部分提取出能有效抑制根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefa-ciens）QS的活性物質（Adonizio et al.，2006）。雖然已從許多植物中提取出QSIs活性物質，卻很少應用于植物病害防治，但隨著研究的深入，一旦從植物中提取出具有信號分子抑制活性的物質，即可通過轉基因技術達到防治植物病害的目的。（2）合成QS信號分子降解酶，使由QS調控的致病基因無法正常表達。植物自身很少產生信號分子降解酶，但目前已從一些微生物中發現AHLs降解酶，其中，芽胞桿菌產生的內酯酶aiiA應用最廣，將aiiA蛋白轉入植物中，發現植物對歐文氏菌具有較好的抗性（Dong et al.，2001；Reimmann et al.，2002）。（3）根據天然QSis的結構人工合成QSIs，并使其在植物體內大量表達，抑制侵染植物的病原菌的致病力。（4）利用信號分子在植物體內的微量表達刺激植物免疫系統發生反應。宋水山（2010）用幾種細菌信號分子AHL處理幾種歐文氏菌常見寄主，發現處理后植物體內與自身防御反應相關的酶的活性提高；擬南芥能較好地防御由軟腐歐文氏菌引起的軟腐病。若將細菌AHL合成酶基因轉入植物，植物可合成QS信號分子，在病原菌尚未產生QS前就能控制信號分子AHL的作用，提高了植物的抗性。如表達胡蘿卜軟腐歐文氏菌的N-3-氧代己酰基高絲氨酸內酯合成酶基因expI的轉基因煙草對歐文氏菌的抗病性提高（宋水山等，2005）。

2 QSIs種類及應用

QSIs以QS分泌的信號分子為靶標，不會影響病原菌的正常活動，極大地減少了病原菌耐藥性的產生。根據QSis分子的性質，可將其分為非肽類小分子化合物、肽類化合物（主要是AIPs同系物）和蛋白質（主要為QS猝滅酶）（程古月等，2012）。

2.1非肽類小分子化合物

2.1.1天然來源OSis 植物可產生QSI活性以降低侵染菌的致病能力（圖2），病原菌釋放AHL分子導致生物被膜及冠癭形成。另一方面，這些植物會對細菌產生的信號分子作出反應，通過釋放AHL模擬化合物用于防御，進而影響細菌的QS系統（Kalia and Purohit，2011）。目前已有許多文獻報道了從自然植物資源中可分離獲得QSIs，由于這些植物可被人類消耗，因此具有QS抑制活性的化合物被認為具有安全，不會對人類細胞造成毒害作用。最先發現具有抑制QS活性的天然產物是由海洋紅藻（Delisea pulchra）產生的鹵代呋喃酮，研究發現鹵代呋喃酮在幾個革蘭氏陰性菌中通過干擾信號分子AHL與受體蛋白LuxR的結合來干涉AHL調控QS（Chong-Lek et al.，2013）。

除海洋紅藻外，從一些高等植物中也分離獲得QSI活性物質，但目前從植物中提取出的QSls大多用于醫學上，很少用來防治植物病害。因此，了解植物產生的QSIs活性物質及其作用機理，將植物本身產生的QSIs應用于植物病害防治將是一個重要的研究方向。

自然界中一些拮抗菌能通過營養競爭作用、產生抗生素、誘導植物本身的防御系統及重寄生作用來干擾病原菌QS，因此，拮抗菌分泌的抗生素和次級代謝產物可成為一種重要的天然QSIs。研究發現，銅綠假單胞菌分泌的抗生素及其次級代謝產物吩嗪類化合物能有效防治小麥全蝕病，對水稻枯萎病病原菌、辣椒疫菌和黃瓜炭疽病菌也具有抑制效果（孔麗萍，2008）。

2.1.2人工合成QSIs 雖然許多天然化合物具有QSIs活性，但其產量并不足以滿足大范圍的植物病害防治，因此人們根據天然溴化呋喃酮的結構對取代基和側鏈長度稍加改動，設計了具有QSIs活性的化學分子庫（程古月等，2012）。如Manny等（1997）合成的如呋喃酮56可阻斷AHL分子與受體蛋白結合，并已取得明顯的結果。另外，C₅O₂Br₂和CsHOzl3r能通過加速LuxR的周轉代謝來抑制QS；C₉H₁₀O₂Br₂能抑制基于AHLs和AI-2s的OS系統。目前，大部分人工合成的抑制劑主要對哺乳動物致病菌的QS有效，對植物病原菌的QS抑制研究甚少，因此有待進一步探究，以確認人工合成QSIs對植物病害的防治效果。

除上述信號分子結構類似物外，人們根據天然的抑制劑分子結構從一些小分子化合物中篩選出一系列能有效抑制病原菌QS的單體化合物，如吡咯酮類化合物。Kaufxnann等（2005）發現吡咯二酮化合物能抑制生物被膜的形成，干擾假單胞菌進行群體交流。陳衛民等（2009）的研究結果顯示，吡咯酮化合物是比呋喃酮更有潛力的QSIs的先導化合物。

2.2肽類化合物

在QSIs中，最常見的肽類化合物是AIPs同系物。AIP是一種小分子多肽，是革蘭氏陽性菌的自誘導分子。Mayville等（1999）發現AIP分子的尾部發生改變只能影響細菌本身二元信號轉導（agr）系統的活化，但依然能抑制跨細菌種屬的QS。基于這一原理，人們設計了一些尾部結構不同的AIPs同系物作為QSIs。如尾部丙氨酸被修飾的幾種AIPs類似物可有效抑制跨細菌種屬的QS系統（Mayville et al.，1999）。一個只含有硫內酯環結構的All肽既能感染病原菌群體內的QS，也能抑制群體問的QS（Lyon et al.，2000）。通過對AIP分子三維構效關系的研究，Lyon等（2000）發現TrAIP-Ⅱ可破壞信號傳導，抑制細菌QS，從而降低細菌的毒力。除了環狀的AIP肽外，一種線狀的RNAⅢ抑制肽（RIP）能減弱病原菌的毒力（Balaban et al.，2005）。

2.3 QQ酶

一些細菌能產生一種降解AHLs的酶——AHL內酯酶，其能水解酰基高絲氨酸內酯環（Scutera et al.，2014）。Dong等（2001）研究表明，一種芽孢桿菌能產生?；呓z氨酸內酯酶基因aiiA基因，其編碼的蛋白質酶能降解胡籮卜歐文氏菌產生的AHL，極大程度上減弱了該病菌的致病性。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1中 B.cereus菌株A24 aiiA的表達會弱化一些QS控制的功能，如AHL積累和毒力因子的表達及分泌（Reimmann et al.，2002）。Mei等（2010）也研究發現，表達AHL內酯酶基因aidH的Pectobacterium carotovorum內AHL信號分子產量極大減少，其在一些主要寄主上的致病力也顯著下降。近年來，我國也開展了AHL信號降解酶的研究，發現植物青枯菌（Ralstonia solanacearum）菌株中的aac基因編碼的蛋白能有效降解細菌QS信號分子（張爭等，2008）。轉入aiiA基因的西甜瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）菌株信號分子的產生顯著降低，果斑病癥狀明顯減輕（陳濤等，2008）；該基因的轉化植株也能防御P.carotovorum引起的軟腐病（柴鑫莉等，2007；馬宏等，2009）。

在發現QQ內酯酶aiiA后不久，Leadbetter和Greenberg（2000）分離出一種能利用AHL作為能量和氮源的Vanovorax paradoxus菌株，降解該AHL需要AHL?；D移酶。AHL?；D移酶隨后也在P.aeruginosa、Ralstonia strains、Comamonas sp.、She-wanella sp.和Ochrobactrum sp.等中被鑒定出來（Su-sanne，2015）。因為AHLs有不同的酰基鏈長度，其為AHL?；柑峁┮鬃冃裕↙in et al.，2003）。不同酰化酶對不同長度AHL的作用效果也不同。真氧產堿桿菌中的AHL?；窤iiD對超過8個碳的長鏈AHLs更有效（Ren et al.，2002）。相反，鏈霉菌M664中的AHL?；冈阪滈L度少于8個碳時具有高效性（Park et al，2005）。許多AHL酰化酶等位基因有降解長鏈AHLs的偏好。然而，Uroz等（2007）從毛單胞菌中發現有不同活性的酰化酶，能降解?；滈L度4～16碳的AHLs。

一系列的研究已顯示紅球菌（Rhodococcus）有QQ能力。紅平紅球菌（R.erythropolis）W2擁有AHL內酯酶和AHL酰化酶活性。在植物內，紅平紅球菌能明顯減少馬鈴薯塊莖中果膠桿菌屬Carotovorumsp.的致病性（Kiran et al.，2008）。近年來發現有的真菌也能降解AHLs酶，如Phialocephala、Ascomyce-tes和Melinimyces已被證實擁有作用于C6HSL和30C6HSL內酯環的內酯酶活性（Kalia and Purohit，2011）。

3展望

作為一種新型的植物病害防治策略，基于QS系統調控的植物病害防治途徑不影響病原物的正常生長，只是調控病原菌致病因子的正常表達，使病原菌不能侵染寄主或降低致病力，從而有效控制植物病害，且不易使病原菌產生抗性（Scutera et al.，2014）。理論上，QSis與傳統的化學防治試劑相比具有以下優點：（1）QSIs并不妨礙病原菌的正常生長代謝，而是抑制QS系統，減弱病原菌的毒力，降低其致病性。這樣既可有效抑制植物病害，又能緩解病原菌產生耐藥性，而且能減少對有益菌的殺傷。（2）由于作用機制不同，QSis可與其他農用抗生素聯用，以增強抗菌療效，減少化學試劑的用量，在有效治療相關病害的同時，減少環境污染及防治費用（孫琦，2014）。

自發現可利用病原微生物QS以防治植物微生物病害以來，科學家們對OS抑制的研究從未停歇。大量研究表明，向植物中轉AQS信號降解酶基因培育出的轉基因植物能較好地防治植物病害，具有很好的應用前景。如轉基因植物對果膠桿菌引起的軟腐病已表現出明顯的抗性。除了研究轉基因植物，向植物體內注入QSIs，在病原菌侵染宿主前即抑制信號分子的作用，也能有效防治植物病害。植物本身就能產生QSis，但合成量較少。越來越多人工合成的QSis應用于實際生產，初步解決了自然資源中QSis合成量很少的不足。

在今后的研究中，利用現有的理論基礎開展QSis篩選和基于QS系統淬滅機制的植物病害防治有望成為植物病害防治工作的重要方向之一，為此應加強以下方面的工作：（1）拓寬QSIs研究范圍，使其在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中均能廣泛應用。目前的QSis主要針對革蘭氏陰性菌的AHLs，而針對AT-1、AI-2及最新發現的信號分子AI-3（陳偉，2011）的抑制劑很少被報道。（2）加大QQ酶的研究力度。在多種QSIs中，QQ酶的毒性最小，被認為是最安全有效的酶類（范興輝等，2017）。（3）AHLs的QQ酶在植物病害防治中存在一些需要解決的問題，如淬滅酶在植物體內的穩定性、催化效率、底物特異性、在應用過程中是否存在副作用及預防措施等。（4）植物能監測到QS信號分子的存在，并作出相應的應激反應（Kalia and Purohit，2011），但目前對有關植物產生的各種QS信號分子類似物的化學結構和性質了解較少，關于AHL信號在植物體內的信號轉導途徑及信號分子受體及其與受體的特異性結合的研究也不常見。為全面了解植物體內受AHL影響而發生變化的生理生化特性及相關基因的表達，還需開展更深入的研究。（5）QS現象廣泛存在于各種微生物中，但目前只了解部分模式細菌群體的QS及其抑制方法，對于一些重要致病細菌及真菌QS系統的研究并不深人，因此應加強這方面的研究，如真菌致病性與QS的聯系、QS信號的區分、QSis的篩選等，為大量植物細菌或真菌病害提供新型綠色安全的防控措施。