大腸桿菌Nissle 1917菌株莢膜多糖合成基因kfiA的功能研究

安翠英 周賢軒

摘要[目的]分析益生菌EcN的莢膜多糖合成基因簇，尋找致病性大腸桿菌K5菌株的肝素前體多糖替代來源。[方法]通過基因敲除、基因回補、1H核磁共振（NMR）檢測等技術手段，研究了kfiA基因在EcN莢膜多糖合成過程中的功能。[結果]利用λ-red重組系統成功構建了kfiA突變株，利用NMR檢測發現kfiA缺失突變株的莢膜多糖特征峰消失，又通過染色體重組技術，把kfiA基因插入了EcN突變株的基因組中，核磁共振檢測重新發現了莢膜多糖特征峰。[結論]kfiA基因是EcN菌株莢膜多糖合成途徑的一個關鍵基因，參與了莢膜多糖合成。λ-red重組系統與染色體重組技術同樣適用于EcN菌株，可為后續的菌株改造提供參考。

關鍵詞莢膜多糖；肝素前體；大腸桿菌Nissle 1917；核磁共振

中圖分類號Q939.9 文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）23-0119-04

The Key Role of kfiA Gene in Synthesis of Capsular Polysaccharide of Escherichia coli Strain Nissle 1917

AN Cuiying，ZHOU Xianxuan*

（School of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）

Abstract[Objective] The aim was to analyze genes in heparosan synthesis of EcN heparosan， and find out alternative sources of heparin precursor polysaccharide for E. coli K5 strain. [Method] We studied the key role of kfiA gene in heparosan synthesis by using the techniques， such as gene knockout， gene knockin， NMR， and so on. [Result] The kfiA was knock out with the λred recombination system. The NMR analysis showed that disappeared the specific signal of heparosan from the kfiA mutant. Furthermore， the complementary strain with a kfiA gene inserted into the EcN chromosome was constructed with a phage helped recombination system. The insertion of kfiA restored the synthesis of heparosan and the specific signal of heparosan in the NMR spectrum. [Conclusion] The kfiA plays a critical role in the synthesis of EcN heparosan. Furthermore， both the λred recombination system and the phage helped recombination system are useful as a tool for strain engineering in EcN.

Key wordsCapsular polysaccharide；Heparosan；E. coli Nissle 1917；NMR

肝素是一種應用廣泛的抗凝血藥物。目前，藥物類肝素主要從豬小腸黏膜等動物組織中提取純化。動物源的肝素生產具有一些缺點，如病原污染[1]、貨源不穩定、環境污染等。新的非動物源肝素是一個很有前景的替代品，如化學及酶法合成肝素[2]。受到成本和產量等因素的影響，很有必要對非動物源生物工程肝素及其衍生物的合成進行深入研究。

生物工程肝素的合成以肝素前體多糖為碳鏈骨架，需要對該糖鏈上的羥基進行磺基化修飾，使其具有抗凝血活性。肝素前體多糖主要提取自大腸桿菌K5菌株的莢膜，又可稱為莢膜多糖。大腸桿菌K5菌株的肝素前體多糖的二糖骨架與肝素結構相似，但沒有被硫酸化，其中的葡糖醛酸也沒有被異構化為艾杜糖醛酸[3]。在E.coli K5基因組中，控制莢膜多糖合成的基因簇由3個不同的區域組成，即Region 1、Region 2和Region 3。其中，Region 1和Region 3的基因主要負責將多糖鏈從細胞內轉運到細胞外；而Region 2 包括kfiA、kfiB、kfiC和kfiD基因，它們編碼的蛋白質通常被認為參與了控制多糖鏈的合成。Region 1由6個基因（kpsFEDUCS）組成，是一個單獨的轉錄單元。在kpsF上游處有一個δ70啟動子（PR1）。Region 3的kpsM、KpsT基因負責轉運多糖鏈跨過細胞膜。Region 3的啟動子從kpsM基因上游741 bp處開始轉錄，控制Region 3及Region 2的基因表達。肝素前體多糖結構為[-GlcUA-β（1，4）-GlcNAc-ɑ（1，4）-]n，GlcUA表示葡萄糖醛酸，GlcNAc表示N-乙酰氨基葡萄糖，n的平均值約為70）[4]。

大腸桿菌K5菌株是一種病原菌，能夠感染人的泌尿系統，形成生物被膜，難以治愈。因此，以大腸桿菌K5菌株的莢膜多糖作為肝素前體多糖的來源，存在安全風險。大腸桿菌Nissle 1917（EcN）菌株與大腸桿菌K5菌株的莢膜多糖合成基因簇具有相似性。EcN是腸道益生菌，有益生菌的諸多特性。它能夠合成3種不同類型的菌毛粘附于腸上皮細胞，可有效地在腸道中定殖，形成較強的生物被膜以抵御病原菌的入侵。在腸道中，EcN形成生物被膜的能力要強于致病性大腸桿菌[5]。EcN分泌小菌素H47和小菌素M能夠對其他病原菌產生拮抗作用[6]。EcN菌體表面的O6抗原具有特殊的脂多糖結構，EcN的這種特殊的多糖結構使其具有免疫調節作用，可以增強宿主體內的免疫調節能力[7]。EcN的H1型鞭毛使菌體具備較強的遷移能力，有利于菌體廣泛分布。此外，這種益生菌還具有6種不同的攝鐵系統，可通過競爭Fe3+來抑制鼠傷寒沙門氏菌等致病菌在腸道中的定殖[5]。為了找到致病性大腸桿菌K5菌株的肝素前體多糖替代來源，筆者分析了益生菌EcN的莢膜多糖合成基因簇，通過基因敲除、基因回補、NMR檢測等技術手段，研究了kfiA基因在EcN莢膜多糖合成過程中的功能。

1材料與方法

1.1材料

克隆載體pKD4、pKD46、pCP20、pAH123、pAH162，大腸桿菌菌株EcN、BW25142，均由合肥工業大學生物與食品工程學院保存。高保真PrimeStar DNA聚合酶、限制性內切酶Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、DNA 連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver 2.1購于TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶購于北京全式金生物技術有限公司；SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為進口分裝或國產分析純。引物（表1）設計采用Vector NTI 8.0軟件，由通用生物系統（安徽）有限公司合成。大腸桿菌培養所用的抗生素為氨芐青霉素（Ap，100 μg/mL）、卡那霉素（Kan，50 μg/mL）、四環素（Tet，2 μg/mL）。

1.2方法

1.2.1EcN菌株中kfiA基因敲除。

EcN菌株中kfiA基因敲除采用已發表的大腸桿菌K12菌株基因敲除方法，并作少量修改[8]。根據EcN中kfiA基因編碼區的序列（GenBank登陸號：AJ586888.1）上下游39 bp為同源臂設計擴增引物P0227/P0228。聚合物鏈式反應（PCR）以pDK4為模板擴增基因敲除片段FRT-Kan-FRT，反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃總延伸10 min。PCR產物經PCR產物純化試劑盒純化后直接轉化EcN/pKD46電擊感受態細胞?？强剐云桨逵糜趉fiA突變株的篩選。

抗性平板上的單菌落重懸于超純水中，作為PCR模板。PCR體系中加入4條引物，分別為抗性基因Kan上的通用檢測引物P0019/P0020及EcN基因組kfiA基因上下游200 bp處的檢測引物P0229/P0230。反應條件：98 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，30個循環；72 ℃總延伸10 min。

1.2.2抗性基因的去除。

將溫敏型質粒pCP20轉化EcNΔkfiA：：Kan中，挑取單菌落于LB培養基（Ap 100 μg/mL），30 ℃過夜培養。取菌液劃線于LB平板，42 ℃培養過夜（高溫誘導質粒丟失）。將單菌落分別依次劃線于Ap100板、Kan50板、LB板，37 ℃培養。選擇只能在LB板上正常生長的菌落進行PCR檢驗。PCR檢測得到的陽性菌送至通用生物系統（安徽）有限公司進行測序檢驗。利用Vector NTI 8.0軟件將測序結果與預測序列進行比對。

1.2.3莢膜多糖的檢測。將過夜菌液稀釋至OD600=0.2，接至30 mL 新鮮培養基，37 ℃振蕩培養過夜。以12 000 r/min離心5 min，收集上清液各10 mL，去離子水透析。冷凍離心干燥后的樣品用500 μL D2O重懸，加入5 μL對苯二甲酸二鈉作為內標，混勻后加入核磁管送樣進行NMR分析[9]。

1.2.4pAH162-kfiA載體構建。

按照kfiA 基因序列設計引物：P0262/P0265，兩端分別引入Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ，KpsMP擴增引物：P0011/P0012，兩端分別引入Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ，兩段DNA序列通過Pst Ⅰ 位點酶切連接成片段KpsMP-kfiA，連接體系通過膠回收得到目的條帶。為了保證啟動子KpsMP能夠正常啟動kfiA基因的轉錄，設計引物拼接P0291/P0292。將KpsMP-kfiA片段通過Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ 酶切連接構建到載體pAH162中，重組載體命名為pAH162-kfiA，重組載體通過測序鑒定。

1.2.5kfiA基因的回補。

將pAH162和重組載體pAH162-kfiA分別電擊轉化進電擊感受態EcNΔkfiA/pAH123中，通過四環素抗性平板篩選得到的單克隆用PCR進行鑒定[10]。PCR體系中加入4條引物，分別為抗性基因上的通用檢測引物P0028/P0029及EcN基因組IntΦ80位點的上下游檢測引物P0078/P0079。反應條件：98 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，46 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，30個循環；72 ℃總延伸10 min。獲得的陽性克隆分別命名為EcNΔkfiA IntΦ80：： pAH162和EcNΔkfiA IntΦ80：： pAH162-kfiA。

2結果與分析

2.1EcN菌株中kfiA基因敲除高保真酶擴增質粒pKD4中的FRT-Kan-FRT片段，用于基因敲除。PCR產物片段長1 574 bp（圖1a），電泳結果與目的片段大小一致。

利用λ-Red重組系統進行kfiA基因在EcN菌株中的敲除[8]。在EcN/pKD46菌株誘導表達的重組酶作用下，FRT-Kan-FRT片段中同源臂序列可以和基因組上的同源序列發生同源重組。利用PCR反應檢測kfiA基因突變陽性克隆。菌落PCR體系中加入4條引物，條帶大小分別為1 175、761 bp（圖1b），電泳檢測結果與預期相符，9個菌落全為陽性菌。

45卷23期安翠英等大腸桿菌Nissle 1917菌株莢膜多糖合成基因kfiA的功能研究

2.2kfiA突變株的莢膜多糖檢測

利用1H核磁共振鑒定突變株是否能夠合成莢膜多糖。首先提取EcN和EcNΔkfiA的莢膜多糖，將水溶性的穩定且不與樣品反應的對苯二甲酸二鈉添加到樣品中作為內標，用1H核磁共振進行鑒定。得到譜圖如圖2a所示，可以看出在1H NMR譜約為2 ppm處存在特征峰，是莢膜多糖的N-乙?；系臍浞澹℅lcNAc，-CH3）。核磁波譜用MestReNova軟件進行分析，利用峰面積對莢膜多糖的含量進行測定，如圖2b所示，野生型能夠正常合成莢膜多糖，而kfiA突變株完全不能合成莢膜多糖，說明EcN菌株的kfiA基因對該菌株莢膜多糖合成的重要性。

提取菌落PCR檢測的陽性菌株的質粒，利用限制性酶切反應進行檢驗。電泳檢測結果如圖3b所示，質粒被限制酶切成2個片段，條帶分別為2 883和1 776 kb，條帶大小與預期相符。為了排除PCR擴增的DNA片段出現堿基突變和移碼突變的可能性，試驗中還對拼接的DNA片段進行了序列測定。測序結果與預期相符，沒有堿基突變和移碼突變。

2.4kfiA基因的回補

從菌落PCR檢驗、質粒酶切檢驗，以及測序檢驗都符合預期的菌株BW25142/pAH162-KpsMP-kfiA中提取質粒，并通過電擊轉化，將重組質粒轉化進EcNΔkfiA/pAH123感受態中，菌落PCR檢測結果如圖4所示，泳道1和4以EcNΔkfiA為模板作為對照，泳道2和5、3和6分別是同一單克隆，在泳道1～3的PCR體系中加入4條引物：P0028、P0029、P0078、P0079，用來檢測重組質粒是否插入IntΦ80位點，在泳道4～6的PCR體系中加入引物P0230/P0263用來檢測原來的kfiA基因是否被敲除。

在泳道2、3中可以擴出2個DNA條帶，且與預期大小相符，說明重組質粒已經成功插入到EcN基因組的IntΦ80位點。泳道5、6條帶大小與泳道4（EcNΔkfiA）一致，說明所挑選的2個單克隆均為陽性克?。‥cN ΔkfiA IntΦ80：：pAH162-KpsMP-kfiA）。

2.5kfiA突變株及回補菌株的莢膜多糖檢測

提取4株的莢膜多糖并通過1H核磁共振檢測，核磁波譜用MestReNova軟件進行分析。如圖5a所示，EcN野生型和kfiA回補菌株能夠正常合成莢膜多糖，而kfiA突變株和回補對照菌株不能合成莢膜多糖。將波譜中對二苯二甲酸二鈉的峰面積（化學位移為7.9 ppm）作為標準，分別對4株菌的莢膜多糖的N-乙?；姆迕娣e進行積分，結果如圖5b所示，野生型和回補菌株能夠正常合成莢膜多糖，而kfiA突變株和EcNΔkfiA IntΦ80：：pAH162完全不能合成莢膜多糖，說明kfiA基因是EcN莢膜多糖合成所必需的基因。

3結論與討論

大腸桿菌可以表達超過80種莢膜多糖，這些莢膜多糖

被定義為K抗原。細菌的莢膜多糖通常對菌體的生長和繁殖有著重要影響，還對病毒的侵染具有較強的抵御作用[11]。大腸桿菌K5的莢膜多糖屬于糖胺聚糖類多聚物。其中，K5莢膜多糖又被稱為脫硫肝素，或N-乙酰肝素，由[（→4）β-D-GlcA（1→4）N-acetlyαDGlcNAc（1→）]n重復二糖單元組成。細菌的莢膜多糖未被硫酸化，也沒有差向異構化形成艾杜糖醛酸，這與哺乳動物源的硫酸肝素在結構與活性上都有所差別。以K5莢膜多糖為起始碳鏈骨架，可通過酶法合成非動物源肝素，使其具有抗凝血活性。但是大腸桿菌K5菌株對人體具有致病性，可引起尿道感染。若從大腸桿菌K5的莢膜中提取肝素前體多糖用來合成肝素，必須非常小心，需要經過嚴格的多步純化過程以排除致病因子污染。

據目前的報道，大腸桿菌EcN菌株是益生菌，還沒有發現任何致病因子，被認為是一種安全菌株。在大腸桿菌EcN菌株中具有相似的莢膜多糖合成基因簇，但還缺乏相應的研究，證明這些基因的確切功能及相應的肝素前體多糖合成能力。該研究通過分子生物學技術，對kfiA基因的功能進行了研究，發現kfiA基因編碼產物是該菌株的莢膜多糖合成所必需的蛋白質。kfiA基因的敲除使EcN失去了莢膜多糖合成能力；同時，

該基因的回復突變，又重新恢復了該菌的莢膜多糖合成能力。

目前，關于益生菌EcN肝素前體多糖合成的相應研究較少，該菌的肝素前體多糖合成機制還有更進一步的

研究價值。此外，對益生菌EcN肝素前體多糖生物合成的調控機制研究也將有助于研究宿主對病原菌的抵抗。該研究還表明了λ-red重組系統與染色體重組技術除了可應用于常見的無莢膜菌株之外，同樣適用于具有莢膜覆蓋的大腸桿菌EcN菌株，為后續的菌株改造奠定了技術基礎。

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