犬腎細胞MDCK研究進展

萬玉林 陶世宇 武發菊 柴立麗 安芳蘭 楊進才 劉學榮

摘要綜述了MDCK細胞的來源、生物學特性及培養方式，旨在為今后MDCK細胞的培養及流感病毒細胞介質疫苗的大規模生產提供理論基礎與依據。

關鍵詞MDCK細胞；生物學特性；無血清培養基；微載體；懸浮培養

中圖分類號S859.79文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）23-0096-03

Research Progress on MDCK Cells

WAN Yulin，TAO Shiyu，WU Faju，LIU Xuerong* et al

（Zhongnong Weite Biotechnology Co.，Ltd.，Lanzhou，Gansu 730046）

AbstractThe origin，biological characteristics and culture methods of MDCK cells were reviewed，in order to provide the theoretical basis and foundation for the future culture of MDCK cells and largescale production of the influenza virus vaccine.

Key wordsMDCK cells；Biological characteristics；Serumfree medium；Microcarrier；Suspension culture

基金項目蘭州市科技計劃項目（2014-1-143）。

作者簡介萬玉林（1976—），男，甘肅蘭州人，碩士，從事口蹄疫疫苗生產與細胞培養工藝研發。*通訊作者，副研究員，從事國家重大動物疫病預防用生物制品技術研發。

收稿日期2017-06-20

自20世紀以來，全球共發生了4次流感大流行，每次流感大流行均嚴重危害人類和動物的健康，尤其是禽流感極大地威脅了公共衛生安全，給全世界造成了巨大的經濟損失。疫苗免疫是預防流感大流行和季節性流行的有效手段。目前的流感疫苗主要是以雞胚為介質制備的滅活疫苗，但是這種疫苗存在外源因子易污染、培養周期長、生產成本高、操作步驟繁瑣、疫苗批次間差異大、雞胚連續傳代病毒時易發生抗原變異且難以大量供應等缺陷[1]。然而，隨著國內外大規模細胞培養技術的不斷成熟和應用，以細胞為介質的流感病毒疫苗的制備已是必然趨勢，其中犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細胞是公認的最佳細胞系[2]。

MDCK細胞系是由Madin等[3]于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立而來，其通常是以貼壁方式培養生長的上皮樣細胞并能連續傳代。目前，MDCK細胞系被廣泛用于禽流感病毒、呼腸孤病毒、犬細小病毒、腺病毒及貓粒細胞缺乏癥病毒等病毒的分離、擴增和純化。由于MDCK細胞具有流感病毒易感染、易培養、增殖快及病毒不易變異等特點，被認為是最適合于A型和B型流感病毒疫苗生產的重要細胞系之一[4]。筆者綜述了犬腎細胞MDCK的來源、生物學特性及不同的培養方式，旨在為今后MDCK細胞的培養及流感病毒細胞介質疫苗的大規模生產提供理論基礎和依據。

1MDCK細胞的來源

最初的MDCK細胞系是從犬的腎臟組織中分離獲得的，目前人們可以從美國典型培養物保藏中心（ATCC）、中國典型培養物保藏中心（CCTCC）、中國科學院上海細胞庫、北京協和細胞資源中心及武漢大學菌種保藏中心等保藏中心引進MDCK細胞系，擴大培養后用液氮或商品化的凍存培養液凍存后，建立自己的基礎種子細胞庫。

2MDCK細胞的生物學特性

2.1MDCK細胞的形態

MDCK細胞的來源不同，細胞的形態也不同；MDCK細胞形態一般較為規則，細胞較大，呈梭形或扁平狀，或呈多邊形，其中央有扁圓形的細胞核。

2.2MDCK細胞的生長特性

MDCK細胞通常以貼壁方式生長并可連續傳代，其在細胞方瓶中生長時細胞之間會相互銜接或呈鑲嵌狀而緊密排列，并會集合形成緊密的連接蛋白分泌到其表面，從而形成單層貼壁細胞。MDCK細胞的生長曲線呈S型，且染色體數目2n=78。當細胞密度在90%以上時，其通常用含0.02%EDTA的0.25%胰酶進行消化，室溫一般消化5～10 min，通常按1∶2～1∶4進行傳代。

2.3MDCK細胞的凍存和復蘇

凍存時MDCK細胞通常用含10%～20%的胎牛或新生牛血清、5%～10%DMSO配制的凍存培養液置于液氮中凍存，并調節凍存液中細胞的終密度為5×106～1×107 cells /mL；復蘇時從液氮罐中取出凍存的細胞，直接浸入37 ℃溫水中，按照常規方法均能復蘇細胞，6 h后待細胞完全貼壁后，換加等量的新鮮營養液，以降低DMSO對細胞的毒性作用。

3MDCK細胞的培養方式

3.1傳統培養方式

傳統的MDCK細胞培養大多采用有血清的單細胞層貼壁培養[5]。其中的血清由于是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復雜混合物，含有細胞生長所需的生長因子、載體蛋白、激素、微量元素、貼壁因子以及其他營養物質，能夠有效促進細胞的生長和產物的表達，但血清的使用存在一系列問題：易受微生物、病毒和支原體等的污染；批次間的差異易使不同批次病毒疫苗的質量難以嚴格控制；此外，大量血清蛋白的存在增加了生產疫苗過程中下游分離純化的難度，部分蛋白難以通過分離純化被徹底去除，從而影響了產品的最終質量；此外，血清來源困難、價格昂貴，導致大規模動物細胞培養過程中使用血清時大大提高了生產成本。MDCK細胞有血清的貼壁培養目前僅適用于實驗室的科研研究。

3.2無血清貼壁培養

近年來，有關MDCK細胞的無血清貼壁培養技術取得了較大進展，適合MDCK細胞貼壁生長的幾種商品化無血清培養基相繼問世[6-8]。Gibco公司、Hyclone公司和Sigma-Aldrich公司分別研發出EpiSerf、SFM4MegaVir和Ex-Cell MDCK無血清培養基。MDCK細胞無血清培養基是在經優化的基礎培養基中添加重組人胰島素蛋白和牛轉鐵蛋白的低蛋白含量的成分配制而成。人們通過改變有血清培養基和無血清培養基在MDCK細胞培養過程中的比例，通過無血清貼壁馴化，MDCK細胞可以逐步適應在無血清培養基中生長。研究表明，馴化后無血清貼壁生長的 MDCK細胞貼壁均勻，細胞邊緣輪廓模糊，細胞間的結合更加緊密，而在適應前在有血清培養基中貼壁生長的MDCK細胞輪廓清晰，細胞間的結合不如無血清培養的MDCK細胞緊密。此外，在有血清培養基中培養的MDCK細胞很難被胰酶消化，但在其無血清培養基中培養的細胞卻很容易被胰酶消化。相關研究也表明，MDCK細胞在無血清培養基中生長時細胞較小并緊密成團，但在無血清貼壁培養過程中細胞的延滯期明顯縮短、代謝副產物低、能夠更高效地利用培養基中的葡萄糖且能產生較高的細胞密度和比生長速率，對細胞生長有利，與此同時也克服了MDCK細胞在有血清貼壁培養中血清帶來的諸多不利因素，但其易受細胞培養基質表面積及無血清培養基的化學成分不明確、價格昂貴等因素的限制，目前無血清貼壁培養也只適用于試驗研究，而不適用于MDCK細胞的大規模培養，依然不能滿足病毒疫苗等生物制品生產的需要。

3.3微載體懸浮培養

微載體懸浮培養是目前比較先進的貼壁型細胞的培養技術，近年來國內外有許多利用微載體懸浮培養技術培養MDCK細胞生產流感疫苗等生物制品的報道，該技術能使MDCK細胞和流感病毒均大量增殖。

微載體是直徑60～250 μm的微珠。微載體本身所占體積不大（如1 g Cytodex 1用PBS水化后體積約為20 mL），但其比表面積很大，從而可以獲得較高密度的細胞。目前，微載體種類繁多，適合用于不同特性的細胞株。使用較多的是Cytodex型系列微載體（Cytodex 1、Cytodex 2、Cytodex 3），它們的基質都由葡聚糖交聯而成，其上帶不同的基團而制成性質不同的3種產品類型。Cytodex 1整個載體帶有正電荷，常用于傳代細胞（如Vero、CHO細胞）的培養；Cytodex 2僅表面帶有正電荷；Cytodex 3不帶電荷，其表面被一層膠原包裹，對細胞的貼附具有促進作用，因此更多地被用于無血清培養基微載體培養過程中。MDCK細胞培養使用最多的微載體是Cytodex 1和Cytodex 3。Cytodex 1由陽性二乙氨基乙基基團均勻分布于交聯葡聚糖基質上構成，其電荷密度為1.5～2.0 meq/g。1 g Cytodex 1所提供的表面積為4 400 cm2，當濃度為3 g/L時最高細胞密度在4.0×106 cells/mL以上。

采用微載體培養動物細胞，結合了懸浮培養和貼壁培養的優勢。在MDCK細胞微載體懸浮培養時為了避免血清今后在疫苗生產過程中給下游純化工藝帶來的不利影響，相關研究人員通過探索培養基中能夠促進細胞貼壁的關鍵成分，并篩選出相關水解物，研發出適合MDCK細胞生長的低血清培養基M-LSM，結果表明，對于貼壁型細胞而言，能貼在其支持物表面是其能夠增殖的必要條件，而Ca2+和Mg2+是細胞在低血清培養基中貼壁生長時不可缺少的物質；麥麩水解物可以部分代替培養基中的血清，且不影響MDCK細胞的生長[9]。在此基礎上，他們利用該低血清培養基通過微載體懸浮培養技術，經過消化轉移等操作實現了MDCK 細胞從5 L反應器至25 L反應器的放大培養，結果表明微載體上細胞貼附均勻、生長旺盛，在25 L反應器中MDCK細胞培養48 h后細胞密度可以達到3.05×106cells /mL，該研究結果為更大體積的反應器大規模地利用微載體懸浮培養MDCK細胞提供了借鑒。另外，進行了微載體濃度優化、接種細胞和微載體比例優化、攪拌速度和攪拌方式優化、換液策略優化等培養工藝的研究，推動了MDCK細胞微載體懸浮培養的產業化生產。

3.4單細胞懸浮馴化培養

MDCK細胞大規模培養常因其必須貼附生長而受到限制，前幾年較大規模的MDCK細胞生產流感疫苗常用微載體作為載體，支持MDCK細胞貼附生長。雖然微載體懸浮培養能使MDCK細胞獲得較高的細胞密度，但其消化過程復雜，從而增加了生產時間與生產成本，且步驟繁瑣。然而，單細胞懸浮培養不受細胞生長表面基質的限制，易實現MDCK細胞的大規模生產。相關研究表明，可以通過直接法和間接法馴化MDCK細胞，使之在特定的細胞培養液單細胞懸浮培養。懸浮馴化的MDCK細胞經逐級放大培養后，以之作為載體介質可以制備出有效、安全和高產量的流感病毒疫苗。

在MDCK細胞單細胞懸浮培養馴化前，首先應使其適應在某種成分已知的無血清培養液中培養，此過程通過直接法和間接法馴化可以實現。直接法為完全替換培養液，21 d左右細胞生長速度即可恢復；間接法為逐步替換培養液，即改變有血清和無血清培養液的混合比例，用時2個月甚至更長[10]，細胞能適應無血清培養液。然后，將適應無血清培養液的MDCK細胞，按約0.5×106cells/mL的密度接種至250 mL錐形瓶中，培養體積約60 mL，在細胞培養箱中37 ℃恒溫下振蕩培養。為了避免細胞大量死亡，起始轉速設為30 r/min。馴化期間每天觀察MDCK細胞的生長情況，并使用測糖儀定期測定培養液中葡萄糖的含量，當培養液中葡萄糖含量低于1.0 mg/mL時立即更換培養液。隨著細胞數量的不斷增加，培養轉速也要逐漸增大，從30 r/min可變為45 r/min直至60 r/min，防止細胞結團。相關研究表明，通過直接法和間接法馴化，適應了無血清培養液的MDCK細胞經進一步馴化后均能實現單細胞的懸浮培養，但直接法省時省力，間接法馴化周期較長。

相關研究也表明，單細胞懸浮馴化培養可通過硅化方瓶-搖床體系來實現。具體方法如下：為了阻止MDCK細胞貼壁，首先用硅化劑處理方瓶的表面；其次，通過調整無血清培養基的組分及濃度并不斷對其優化，以便其能夠支持因硅化而未能貼壁的細胞增殖。先讓MDCK細胞在優化后的培養基中靜止培養數小時后，再將細胞全部轉移至未經處理的方瓶中，在搖床上懸浮振蕩培養，設定轉速為60 r/min，在此期間前幾次不傳代，只換營養液，以保證足夠多的細胞，重復幾次后再將細胞上清中的懸浮細胞轉入硅化劑處理過的方瓶中，同樣置于搖床上懸浮振蕩培養，起初每48 h更換新鮮的營養液但不分傳，直至細胞的比生長速率趨于穩定后，每次按約3.0×105 cells/mL的密度進行傳代培養，如此循壞往復將貼壁的MDCK細胞實現單細胞懸浮培養，并能穩定增殖。

相關研究表明，與有血清和無血清貼壁培養方式相比，無血清單細胞懸浮培養的MDCK細胞的延滯期大大縮短，葡萄糖比消耗速率也大幅度降低，生成代謝的副產物較少，細胞比生長率較高，活細胞密度和細胞活力進一步提高，其中無血清單細胞懸浮培養其最大細胞密度是有血清貼壁培養方式的3.6倍，這表明無血清單細胞懸浮培養更有利于MDCK細胞更高密度的生長和規模生產，能有效解決和避免大規模培養MDCK細胞過程中存在的諸多問題。

4結語

傳統的流感滅活疫苗均是利用9～11日齡的非免疫雞胚制備的，然而此種方法存在許多不足，如缺乏可靠的雞胚來源、繁瑣的操作步驟、較高的生產成本 、疫苗批次間較大的差異以及易污染等[11]。隨著國內外大規模動物細胞培養技術的不斷成熟與發展，再加上MDCK細胞本身培養容易、流感病毒易感染、增殖快及病毒不易變異等特點，于是以MDCK細胞為介質代替雞胚來生產流感疫苗是最佳方式。目前，已有MDCK細胞生產的流感疫苗相繼問世。

迄今為止，大規模的MDCK細胞生產流感疫苗主要利用微載體懸浮培養和單細胞懸浮培養方式，其培養過程中主要使用無血清培養基。無血清培養過程可以限制和避免血清帶來的諸多不足，尤其是單細胞無血清懸浮培養方式由于具有細胞比生長率較高、能使細胞達到較高的密度和活力及代謝副產物少等優點，因此其更有利于MDCK細胞高密度的培養和大規模生產，更有利于培養和擴增過程的優化和放大，并能支持流感病毒的復制及獲得較高的滴度，對大規模懸浮培養MDCK細胞增殖流感病毒及制備安全、有效、高質量和高產量的流感疫苗具有重要的應用價值，同時也為利用其他動物細胞來大規模生產病毒疫苗等生物制品提供了依據和借鑒。

參考文獻

[1]

GHENDON Y Z，MARKUSHIN S G，AKOPOVA I I，et al.Development of cell culture （MDCK） live coldadapted （CA） attenuated influenza vaccine[J].Vaccine，2005，23（38）：4678-4684.

[2] LIU J，XIAO S，SCHWARTZ R，et al.Use of MDCK cells for production of live attenuated influenza vaccine[J].Vaccine，2009，27（46）：6460-6463.

[3] MADIN S H，DARBY N B J.Established kidney cell lines of normal adult bovine and ovine origin[J].Proc Soc Exp Biol Med，1958，98（3）：574-576.

[4] TREE J A，RICHARDSON C，FOOKS A R，et al.Comparison of largescale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains[J].Vaccine，2001，19（25/26）：3444-3450.

[5] GENZEL Y，REICHL U.Continuous cell lines as a production system for influenza vaccines[J].Expert review of vaccines，2009，8（12）：1681-1692.

[6] TAUB M，CHUMAN L，SAIER M H，et al.Growth of madindarby canine kidney epithelial cell （MDCK） line in hormonesupplemented，serumfree medium[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76（7）：3338-3342.

[7] MOCHIZUKI M.Growth characteristics of canine pathogenic viruses in MDCK cells cultured in RPMI 1640 medium without animal protein[J].Vaccine，2006，24（11）：1744-1748.

[8] TREE J A，RICHARDSON C，FOOKS A R，et al.Comparison of largescale mammalian cell culture systems with egg culture for the production of influenza virus A vaccine strains[J].Vaccine，2001，19（25）：3444-3450.

[9] 龔迪，易小萍，張元興.MDCK細胞微載體懸浮培養放大工藝研究[J].中國生物工程雜志，2012，32（9） ：55-60.

[10] LOHR V，GENZEL Y，BEHRENDT I，et al.A new MDCK suspension line cultivated in a fully defined medium in stirredtank and wave bioreactor[J].Vaccine，2010，28（38）：6256-6264.

[11] STHR K，ESVELD M.Will vaccines be available for the next influenza pandemic？[J].Science，2004，306：2195-2196.