加拿大藍(lán)靛果忍冬組培快繁技術(shù)研究

姜思佳 焦麗 韓曦 趙利群 李濱勝 崔杰

摘要 [目的]研究加拿大藍(lán)靛果忍冬組培快繁技術(shù)。[方法]以黑龍江省森林植物園選育的加拿大藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品種J-12的葉芽、花芽、莖段、葉片為外植體進(jìn)行組培試驗(yàn)。通過(guò)在MS培養(yǎng)基上附加不同激素配比，篩選出最佳外植體和最佳培養(yǎng)基配方。[結(jié)果]葉芽為最佳誘導(dǎo)外植體。最佳消毒時(shí)間組合為75%乙醇10 s與2% NaClO 4 min，污染率低至2%。J-12藍(lán)靛果忍冬品種誘導(dǎo)葉芽分化及增殖的最佳培養(yǎng)基及激素配比是MS+NAA0.15 mg/L+6-BA1.50 mg/L，增殖倍數(shù)最高可達(dá)8.0倍；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 050 mg/L+NAA0.20 mg/L，生根率為100.00%。[結(jié)論]該研究可為加拿大藍(lán)靛果忍冬的大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 藍(lán)靛果忍冬；組織培養(yǎng)；分化

中圖分類號(hào) S663.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0155-02

A Preliminary Study of Tissue Culture Technique of Canadas Lonicera edulis

JIANG Sijia1，JIAO Li1，HAN Xi1，CUI Jie2* et al

（1.Heilongjiang Forest Botanical Garden，Harbin，Heilongjiang 150040；2.Harbin Institute of Technology，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To study the tissue culture technique of Canadas Lonicera edulis.[Method] The leaf buds，flower buds，stem segments and leaves of the fine strain J-12 which were selected by Heilongjiang Forest Botanical Garden were used in tissue culture test.The best explants and best media formulations were selected by adding different hormone ratios on MS medium.[Result] Leaf buds were the best induced explants.The optimal disinfection time combination was 75% alcohol 10 s and 2% NaClO 4 min，and the pollution rate was low to 2%.The optimal medium for leaf bud differentiation and proliferation of the J-12 was MS+NAA0.15 mg/L+6-BA1.50 mg/L，with a maximum multiplication factor of up to 8.0 times.The best rooting medium was 1/2 MS+IBA0.50 mg/L+NAA 0.20 mg/L，the rooting rate was 100.00%.[Conclusion] The study provided technical support for the largescale production of Canadas Lonicera edulis.

Key words Lonicera edulis；Tissue culture；Differentiation

基金項(xiàng)目 黑龍江省財(cái)政林業(yè)科技推廣示范資金項(xiàng)目“藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品種繁育及栽培技術(shù)推廣與示范”（〔2015〕ST-11號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介 姜思佳（1985—），女，黑龍江哈爾濱人，工程師，碩士，從事林木培育、種質(zhì)資源引種與保存研究。*通訊作者，副教授，博士，從事基因工程應(yīng)用研究。

收稿日期 2017-08-16

藍(lán)靛果忍冬（Lonicera edulis）又名藍(lán)靛果、羊奶子、山茄子，是忍冬科忍冬屬多年生落葉小灌木[1]，果實(shí)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，抗氧化物質(zhì)含量較高[2-8]，是提取食用天然色素的良好資源[9-10]，既可生食又可加工成漿果產(chǎn)品，藍(lán)靛果忍冬還可作為觀賞樹(shù)種[11]，主要分布在我國(guó)東北地區(qū)、內(nèi)蒙古及華北等地區(qū)[12-13]以及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、日本、朝鮮北部。

我國(guó)開(kāi)展藍(lán)靛果忍冬的研究起步比較晚，野生資源日益枯竭，優(yōu)良品種培育進(jìn)展緩慢，引進(jìn)的大部分品種主要來(lái)自俄羅斯。目前關(guān)于藍(lán)靛果忍冬組培快繁技術(shù)的研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展。Ding等[14]、Jin等[15]對(duì)外植體消毒和最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；梁琦蘭等[16]利用嫩枝莖段誘導(dǎo)成功；李桂君等[17]成功誘導(dǎo)出俄羅斯耐寒藍(lán)靛果忍冬組培苗。該試驗(yàn)所使用植物材料是從加拿大引進(jìn)的優(yōu)良品種，目前國(guó)內(nèi)對(duì)其組培技術(shù)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究以黑龍江省森林植物園選育出的優(yōu)良品種J-12為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)，將組培快繁技術(shù)研究與培育新品種相結(jié)合，有助于提高幼苗繁殖效率、加速育種進(jìn)程、保護(hù)和合理利用藍(lán)靛果忍冬種質(zhì)資源以及優(yōu)良品種的示范推廣。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)材料為黑龍江森林植物園選育的加拿大藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品種J-12。組培試驗(yàn)在哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品研究院進(jìn)行。

1.2 外植體的獲得和消毒

12月份采集藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品種J-12的冬眠枝條，用自來(lái)水清洗，除去表面灰塵，然后進(jìn)行水培。開(kāi)始階段，每3 d更換1次清水，萌芽后每5 d更換1次清水。

將長(zhǎng)出的葉芽、花芽、莖段、葉片作為組織培養(yǎng)的試驗(yàn)材料，取試驗(yàn)材料放入自來(lái)水下沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，然后用70%乙醇溶液表面消毒10 s，取出后用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，再用2%NaClO溶液消毒2～10 min，無(wú)菌蒸餾水沖洗3次，最后放在無(wú)菌濾紙上將多余的水分吸干，以降低污染率和減少玻璃化情況的發(fā)生，篩選出最佳的時(shí)間組合。

1.3 最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA（1.00、1.50、2.00 mg/L）和NAA（0.10、0.15、0.20 mg/L），采用2因素3水平正交設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種25瓶。接種后放入培養(yǎng)箱，16 h/d光照，光照強(qiáng)度為2 000 lx，箱內(nèi)溫度調(diào)節(jié)在（25±2）℃，濕度70%～80%。每天觀察培養(yǎng)物情況，30 d后統(tǒng)計(jì)不同處理方式的誘導(dǎo)率，并觀察記錄其生長(zhǎng)狀況。

1.4 最佳生根培養(yǎng)基的篩選

將誘導(dǎo)出的叢生不定芽切成高2.5～3.0 cm的若干單株，接入1/2MS、1/2MS+IBA 1.00 mg/L+NAA 0.20 mg/L、1/2MS+IBA0.50 mg/L+NAA 0.20 mg/L 這3種生根培養(yǎng)基中。經(jīng)過(guò)30 d培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)各生根培養(yǎng)基中試管苗的生根率。

1.5 煉苗及移栽

將試管苗的封口膜除去，室溫（25～30 ℃）下遮陽(yáng)煉苗3～5 d，然后從瓶?jī)?nèi)取出試管苗，輕輕洗除試管苗根部的瓊脂，移栽到經(jīng)過(guò)高錳酸鉀消毒的基質(zhì)中，空氣濕度保持在80%以上。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excsl 2007和SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間效果

采用75%乙醇和2%NaClO組合進(jìn)行消毒試驗(yàn)，其中乙醇消毒時(shí)間為10 s，NaClO消毒時(shí)間設(shè)置為2、4、6、8、10 min。試驗(yàn)結(jié)果表明接種材料的最佳消毒方式是用無(wú)菌水沖洗3次，后用75%乙醇消毒10 s，再用無(wú)菌水沖洗3次，再用2%NaClO消毒4 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次，平均污染率低至2%（表1）。

2.2 不同外植體的篩選

外植體分別為水培后的葉芽、花芽、莖段、葉片（5 mm×5 mm），采用完全隨機(jī)分組試驗(yàn)，每種材料接種25瓶，重復(fù)3次。由表2可知，葉芽和莖段的分化率較高，分別為93.33%、50.67%，而花芽和葉片的分化率均為0，葉芽為最佳外植體。

2.3 不同激素濃度對(duì)外植體分化的影響 將藍(lán)靛果忍冬J-12外植體葉芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，7 d后葉芽開(kāi)始萌動(dòng)，并逐漸伸長(zhǎng)，15 d后芽長(zhǎng)到1.0～1.5 cm，30 d后芽高平均達(dá)3.0 cm，呈嫩綠色。不同濃度NAA、6-BA激素配比對(duì)藍(lán)靛果忍冬J-12葉芽誘導(dǎo)率以及增殖倍數(shù)有極顯著的影響（表3）。多重比較結(jié)果表明，藍(lán)靛果忍冬外植體在5號(hào)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高，達(dá)97%。NAA的3個(gè)水平中，0.15 mg/L的增殖倍數(shù)最大；6-BA的3個(gè)水平中，1.50 mg/L的增殖倍數(shù)最大。確定藍(lán)靛果忍冬J-12誘導(dǎo)葉芽分化及增殖的最佳培養(yǎng)基及激素配比是MS +NAA 0.15 mg/L+6-BA 1.50 mg/L，增殖倍數(shù)可達(dá)8.0倍。

2.4 最佳生根培養(yǎng)基的篩選

將誘導(dǎo)出的叢生不定芽切成高2.5～3.0 cm的若干單株，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)到20 d左右時(shí)，試管苗開(kāi)始長(zhǎng)根。接種到1～3號(hào)生根培養(yǎng)基上的試管苗均能長(zhǎng)出白色的根，但根的數(shù)量和長(zhǎng)度存在顯著差異。由表4可知，3號(hào)生根培養(yǎng)基生根效果最好，培養(yǎng)到30 d左右時(shí)，生根率達(dá)100.00%，平均根長(zhǎng)8.3 cm，此時(shí)試管苗健壯，可進(jìn)行煉苗。

2.5 移栽基質(zhì)的選擇

準(zhǔn)備3種移栽基質(zhì)：細(xì)沙、草炭土 ∶細(xì)沙=2 ∶1、珍珠巖。試管苗經(jīng)煉苗后，分別栽入3種基質(zhì)中。栽培35 d后統(tǒng)計(jì)試 管苗的成活率及苗高。由表5可知，不同移栽基質(zhì)對(duì)試管苗的成活率和苗高都有顯著影響。試管苗在細(xì)沙基質(zhì)中成活率達(dá)80%；在草炭土+細(xì)沙的混合基質(zhì)中成活率達(dá)92%，苗高最高（10.80 cm）；在珍珠巖基質(zhì)中成活率較低（44%），可見(jiàn)最佳移栽基質(zhì)為草炭土 ∶細(xì)沙=2 ∶1。

3 結(jié)論

（1）加拿大藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品種J-12的葉芽為最佳誘導(dǎo)外植體。

（2）最佳消毒時(shí)間組合為75%乙醇10 s與2%NaClO 4 min，污染率低至2%。

（3）誘導(dǎo)葉芽分化及增殖的最佳培養(yǎng)基及激素配比是MS+NAA0.15 mg/L+6-BA1.50 mg/L，增殖倍數(shù)最高可達(dá)8.0倍。

（4）最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.50 mg/L+NAA0.20 mg/L，生根率為100.00%。

（5）最佳移栽基質(zhì)為草炭土 ∶細(xì)沙=2 ∶1，成活率達(dá)92%。

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