七葉一枝花總黃酮提取工藝優(yōu)化

王永立　袁浩　樊淑華

摘要：【目的】利用響應(yīng)面法對微波輔助提取七葉一枝花總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高七葉一枝花總黃酮提取量，為實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐?！痉椒ā吭趩我蛩卦囼?yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和微波功率3個(gè)主要影響因素進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選七葉一枝花總黃酮提取最佳工藝參數(shù)。【結(jié)果】建立了七葉一枝花總黃酮提取量（Y）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）和微波功率（C）的回歸模型：Y=4.90+0.30A+0.51B+0.48C-0.19AB+

0.44AC+0.24BC-0.85A2-0.83B2-0.55C2（R2=0.9734），擬合程度較高。3個(gè)影響因素及乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波功率的交互作用對七葉一枝花總黃酮提取量有極顯著影響（P<0.01）；微波輔助提取七葉一枝花總黃酮的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比17∶1、微波功率528 W，在此條件下七葉一枝花總黃酮提取量為5.28 mg/g，與預(yù)測值（5.18 mg/g）的相對誤差為1.93%。【結(jié)論】以響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取七葉一枝花總黃酮工藝參數(shù)具有一定的可行性，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 七葉一枝花；總黃酮；微波輔助提取；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）04-0698-06

Abstract：【Objective】In the present study， response surface methodology was applied to optimize the process conditions for the microwave-assisted extraction of total flavonoids from Paris Polyphylla， in order to improve the extraction yield of total flavonoids and provide technique support for actual production. 【Method】Based on single factor experiments， three major parameters including alcohol volume fraction， microwave power and liquid-solid ratio were optimized using Box-Behnken certral composite design， in a bid to select the optimal process parameters for total flavonoids extraction from P. Polyphylla. 【Result】The regression model based on extraction of total flavonoids from P. Polyphylla（Y）， ethanol volume fraction（A）， liquid-solid ratio（B） and microwave power（C） was as follows：Y=4.90+0.30A+0.51B+0.48C-0.19AB+0.44AC+

0.24BC-0.85A2-0.83B2-0.55C2（R2=0.9734）. The fitting degree was high. The three parameters and interaction between ethanol volume fraction and microwave power had extremely significant influence on total flavonoids extraction yield（P<0.01）. The optimal extraction conditions were as follows： ethanol volume fraction 50%， liquid-solid ratio 17∶1 and microwave power 528 W. Under such conditions， the extraction yield was 5.28 mg/g. The relative error was 1.93% compared to the predicted yield（5.18 mg/g）. 【Conclusion】Parameters of microwave-assisted total flavonoids extraction from P. Polyphylla optimized by response surface methodology are feasible， which can be applied to actual production.

Key words： Paris Polyphylla； total flavonoids； microwave-assisted extraction； response surface methodology； process optimization

0 引言

【研究意義】七葉一枝花（Paris polyphylla）又名重樓，為百合科（Liliaceous）重樓屬（Paris）植物，具有消腫止痛、清熱解毒、平喘止咳、涼肝定驚等功效，傳統(tǒng)中醫(yī)常用于治療癰腫、瘡毒、咽喉腫痹、乳癰、蛇蟲咬傷、跌打傷痛、肝熱抽搐等癥（李燾，2011；王嵐等，2014）。七葉一枝花化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有甾體皂苷、植物蛻皮激素、植物甾醇、黃酮、蚤休甾酮及多種氨基酸和微量元素，其中黃酮類物質(zhì)主要包括山奈酚-

3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-（1→6）-β-D-吡喃苷和7-O- α-L-吡喃鼠李糖基—山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-（1→6）-β-D-葡萄糖苷等（童立雷，2012）。作為七葉一枝花主要的活性成分，總黃酮具有調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗氧化和治療心血管疾病等多種生理活性功能（李學(xué)坤等，2014；陳嬋等，2015；楊忠飛和趙成剛，2015）。因此，開展七葉一枝花總黃酮提取工藝研究，對提高七葉一枝花藥用價(jià)值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前有關(guān)七葉一枝花有效成分的研究集中在甾體皂苷（李于善等，2009；童立雷，2012；喻祖文等，2013），其總黃酮含量測定及提取工藝的研究也有一些報(bào)道。王嵐等（2013）通過測定梵凈山七葉一枝花總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)不同年限七葉一枝花的含量不同，其中8年生的總黃酮含量最高；隨后又采用正交試驗(yàn)對乙醇超聲波浸提七葉一枝花總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在最適條件（料液比1∶15、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、浸提溫度70 ℃、浸提3次）下提取獲得總黃酮含量4.92 mg/g（王嵐等，2014）；鐘彥等（2014）對4種重樓屬植物總黃酮含量進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)重樓中總黃酮含量受產(chǎn)地和品種影響較大，其中自采的毛重樓含量最高，為0.1146%；周濃等（2014）采用正交試驗(yàn)優(yōu)化滇重樓總黃酮的提取工藝條件，結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑，回流提取2次，得到總黃酮含量0.0965%。【本研究切入點(diǎn)】總黃酮提取一般采用水提法或有機(jī)溶劑浸提法等常規(guī)方法，但這些方法提取效果差且提取率低。此外，工藝條件的優(yōu)化多采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（王嵐等，2014；陳嬋等，2015；蔣華梅和石登紅，2015），借助響應(yīng)面分析優(yōu)化七葉一枝花總黃酮提取工藝參數(shù)的研究鮮有報(bào)道。正交設(shè)計(jì)作為常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能夠在已有水平條件下獲取適宜的水平組合；但對于未設(shè)定的水平值而言，無法在更大范圍內(nèi)尋找到更為合適的工藝參數(shù)組合。響應(yīng)面法則可以對所取水平的整個(gè)區(qū)域進(jìn)行篩選，得到因素和水平值之間的關(guān)系及最優(yōu)水平組合，結(jié)果分析更有說服力（喻俊等，2015）?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取七葉一枝花總黃酮的工藝條件，篩選出最佳工藝參數(shù)組合，以期提高七葉一枝花總黃酮提取量，為實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

七葉一枝花購自周口市同和堂大藥房，干燥粉碎后過60目篩，于陰涼處密封備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，亞硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁等均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：WF-4000C常壓微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；FW100高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；SHZ-D9（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；AL204電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]；UV-2600型紫外—可見分光光度計(jì)[島津國際貿(mào)易（上海）有限公司]。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總黃酮提取及含量測定 稱取適量樣品粉末置于燒瓶中，加入一定體積乙醇，在一定條件下（乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波時(shí)間和微波功率）進(jìn)行微波輔助提取，溶液減壓抽濾，定容后備用。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用比色法測定總黃酮提取量，以蘆丁濃度C為自變量、吸光值A(chǔ)為因變量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=13.193C-

0.0013（R2=0.9985）。精確量取1.0 mL樣品提取液，于510 nm處測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣液中總黃酮提取量（王嵐等，2014）。

1. 2. 2 提取工藝條件優(yōu)化 選擇影響七葉一枝花總黃酮提取的4個(gè)主要因素進(jìn)行考察，分別以液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1（mL/g）]、乙醇體積分?jǐn)?shù)（15%、30%、45%、60%和75%）、微波功率（100、200、400、600和800 W）和微波時(shí)間（10、20、30、40和50 s）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的最適水平。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定總黃酮最佳提取工藝條件（黃仁術(shù)等，2015）。每處理重復(fù)3次。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003對單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理并制圖，采用Design-Expert 9.0.3構(gòu)建多元二次回歸模擬方程及進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 最適液料比的選擇 由圖1可知，在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、微波功率400 W、微波時(shí)間30 s的條件下，七葉一枝花總黃酮提取量隨著液料比的增大呈先升高后降低的變化趨勢；當(dāng)液料比為15∶1時(shí)，總黃酮提取量最高，為4.07 mg/g。因此，確定提取七葉一枝花總黃酮的最適液料比為15∶1。

2. 1. 2 最適乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化對七葉一枝花總黃酮提取量有明顯影響。在固定液料比15∶1、微波功率400 W、微波時(shí)間30 s的條件下，隨著提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取量呈先升后降的變化趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時(shí)浸提效果最佳。因此，確定提取七葉一枝花總黃酮的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%。

2. 1. 3 微波功率的選擇 由圖3可知，在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比15∶1、微波時(shí)間30 s的條件下，七葉一枝花總黃酮提取量隨微波功率的增加也呈先升高后降低的變化趨勢；當(dāng)微波功率為400 W時(shí)，總黃酮提取量達(dá)最大值（4.76 mg/g）。雖然增加微波功率有利于總黃酮的提取，但過大會(huì)對有機(jī)物質(zhì)造成破壞。因此，確定提取七葉一枝花總黃酮的最適微波功率為400 W。

2. 1. 4 微波時(shí)間的選擇 由圖4可知，在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比15∶1、微波功率400 W的條件下，七葉一枝花總黃酮提取量隨微波時(shí)間的延長呈先逐漸升高后略有下降的變化趨勢。微波時(shí)間為40 s的總黃酮提取量最高，為4.57 mg/g。雖然延長微波時(shí)間可使有機(jī)物質(zhì)提取得更徹底，但過長的處理時(shí)間也會(huì)造成部分提取物分解，且有可能增加其他雜質(zhì)的浸出，從而影響最終的提取效果。因此，確定提取七葉一枝花總黃酮的最適微波時(shí)間為40 s。

2. 2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)方差分析結(jié)果（表1），選取影響七葉一枝花總黃酮提取量的3個(gè)關(guān)鍵因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率）進(jìn)一步研究。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，探索最佳提取條件及因素間的交互作用，以獲得七葉一枝花總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

2. 2. 2 回歸模型的建立和顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 9.0.3對試驗(yàn)結(jié)果（表2）進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，得到七葉一枝花總黃酮提取量（Y）與各提取因素變量的多元二次回歸方程：Y=4.90+

0.30A+0.51B+0.48C-0.19AB+0.44AC+0.24BC-0.85A2-0.83B2-0.55C2。

由表3可知，以七葉一枝花總黃酮提取量為響應(yīng)值時(shí)，回歸模型P<0.01，表明該模型具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P>0.05，說明模型中試驗(yàn)誤差較小，即未知因素的干擾性很小。同時(shí)模型中R2=0.9734，說明其擬合程度較高，能夠用于指導(dǎo)七葉一枝花總黃酮提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

由表3還可知，該模型中一次項(xiàng)A、B、C的P<0.01，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和微波功率對七葉一枝花總黃酮提取效果影響極顯著（P<0.01，下同）；交互項(xiàng)AC的P=0.0067<0.01，即乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波功率的交互作用對七葉一枝花總黃酮提取效果也有極顯著影響，但乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、液料比與微波功率的交互作用對總黃酮提取無顯著影響（P>0.05）。

2. 2. 3 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert 9.0.3對3個(gè)主要因素間的交互作用進(jìn)行分析，以確定其對總黃酮提取量的影響，并繪制兩因素間的交互作用對七葉一枝花總黃酮提取量影響的響應(yīng)曲面圖。由圖5可看出，在相同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，七葉一枝花總黃酮提取量隨液料比的增大呈先升高后降低的變化趨勢；在相同液料比條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，總黃酮提取量呈升高趨勢。由圖6可知，在相同液料比條件下，隨著微波功率的增大，總黃酮提取量先升高后降低；在相同微波功率條件下，總黃酮提取量則隨液料比的增大呈升高趨勢。由圖7可看出，在相同微波功率條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮提取量先升高后降低；在相同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，總黃酮提取量隨微波功率的增大呈升高趨勢。

2. 2. 4 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證 通過對回歸擬合方程和回歸模型分析，得到七葉一枝花總黃酮最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)49.63%、液料比17.24∶1、微波功率528.08 W，總黃酮提取量預(yù)測值為5.18 mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的可靠性，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)操作便利性等因素，將最優(yōu)參數(shù)修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比17∶1、微波功率528 W，在此條件下對總黃酮提取工藝模型進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總黃酮提取量為5.28 mg/g，其相對誤差為1.93%，即證明該模型預(yù)測的準(zhǔn)確性和可行性。

3 討論

植物總黃酮的提取方法較多，包括水提法、醇提法、酶法、超聲波法、微波法、大孔樹脂吸附分離法和超臨界CO2流體萃取法等。每種方法各有特點(diǎn)，其中微波輔助提取法具有提取效率高、適用范圍廣等優(yōu)勢（李學(xué)坤等，2014；黃仁術(shù)等，2015）。本研究以總黃酮提取量為指標(biāo)，利用微波輔助法進(jìn)行醇提，在最佳工藝條件下得到七葉一枝花總黃酮提取量為5.28 mg/g，與超聲波輔助法（王嵐等，2014）相比，所需的乙醇體積分?jǐn)?shù)更小，提取量更大，提取效率更高。

相比于正交設(shè)計(jì)而言，響應(yīng)面法不僅能在更大范圍內(nèi)篩選出合適的試驗(yàn)水平組合，還能分析試驗(yàn)因素對指標(biāo)交互作用的影響（喻俊等，2015）。本研究通過單因素試驗(yàn)篩選出影響七葉一枝花總黃酮提取量的關(guān)鍵因素及最適水平，在此基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 9.0.3進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，建立了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和微波功率3個(gè)關(guān)鍵因素與七葉一枝花總黃酮提取量之間的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化得到3個(gè)關(guān)鍵因素最適參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比17∶1、微波功率528 W，并證明乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波功率間的交互作用對七葉一枝花總黃酮提取量有極顯著影響。響應(yīng)面法獲得的試驗(yàn)結(jié)果較正交試驗(yàn)選取的因素水平范圍更廣，操作性更強(qiáng)。

響應(yīng)面分析中關(guān)鍵因素及水平的確定，需參考Plackett-Burman試驗(yàn)及最陡爬坡法的結(jié)果（梁昌聰?shù)龋?014）；而本研究中關(guān)鍵因素及水平的確定依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，兩者間的結(jié)論是否一致，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，響應(yīng)面分析獲得的最適微波功率與單因素試驗(yàn)確定的最佳功率相差較大，是否因多因素交互作用所致尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立的3個(gè)關(guān)鍵因素與七葉一枝花總黃酮提取量間的數(shù)學(xué)模型回歸效果顯著；優(yōu)化得到的微波輔助提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比17∶1、微波功率528 W，在此條件下得到總黃酮提取量為5.28 mg/g，與理論值基本吻合，即優(yōu)化的工藝參數(shù)具有一定的可行性，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）