華南常用秈稻親本稻瘟病抗性評價及抗性基因鑒定

閻勇　馬增鳳　秦鋼　陳遠孟　秦媛媛　顏群　劉馳　張月雄　黃大輝

摘要：【目的】評價分析華南地區常用秈稻親本稻瘟病抗性及抗性基因，為水稻稻瘟病抗性育種提供理論依據。【方法】利用人工接種鑒定對52份華南地區常用秈稻親本進行稻瘟病抗性分析，同時利用分子標記檢測稻株攜帶的抗性基因，分析親本材料稻瘟病抗性與其所攜帶稻瘟病抗性基因間的關系。【結果】從52份適應華南生態條件的秈稻親本材料中篩選獲得4份廣譜抗源（2份抗譜為100.0%，2份抗譜為92.9%）；常規稻較恢復系和保持系具有更高的稻瘟病抗性。ZA1、ZA9和ZB9生理小種較ZB1和ZB5生理小種表現出更強的致病力，具有較低的抗性頻率。Pi-ta和Pi54基因的出現頻率最高，均為0.42；其次是Pib基因，出現頻率為0.37；Pi-km基因的出現頻率較低，僅0.06；所有秈稻親本材料中均未檢測出Pi9基因。攜帶Pib+Pi54+Pi-km和Pi-ta+Pib+Pi54三基因稻株的抗性高于所有單基因或雙基因稻株。【結論】華南常用秈稻親本材料中存在著優良的稻瘟病廣譜抗源，可利用這些抗源拓寬育種材料的遺傳背景，培育抗病優良品種。多個抗性基因聚合能有效提高稻株對稻瘟病不同生理小種的抗性，在育種實踐中應加強多基因聚合材料的創制和利用研究。

關鍵詞： 秈稻；稻瘟病；抗性基因；廣譜抗源；華南地區

中圖分類號： S511.21 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）04-0587-07

Abstract：【Objective】Blast resistance of main indica rice parent materials in South China and resistance genes were studied， in order to provide reference for blast resistant rice breeding. 【Method】Blast resistance of 52 indica rice parent materials in South China was analyzed by artificial inoculation. The resistance genes were detected by specific molecular markers. The relationship between blast resistance and resistance genes was analyzed. 【Result】Four materials（two with 100.0% resistant spectrum and two with 92.9% resistant spectrum） with broad spectrum resistance to blast were screened out of 52 parent materials. The conventional cultivars showed better resistance than that of maintainer and restorer lines. In comparison with ZB1 and ZB5， the races of ZA1， ZA9 and ZB9 showed stronger pathogenicity， with lower resistance frequency. The occurrence rates of Pi-ta gene and Pi54 gene（both were 0.42） were the highest， that of Pib（0.37） ranked the second. Pi-km gene had the lowest rate（0.06）. Pi9 gene was not found in all parent lines. The materials containing Pib+Pi54+Pi-km or Pi-ta+Pib+Pi54 showed higher resistance level than the plants with single or double resistance genes. 【Conclusion】Main indica rice patent materials in South China contain broad-spectrum resistance resources， which can broaden genetic background and breed resistant rice varieties. Multiple resistance genes pyramiding can strengthen the resistance of rice plant to different races of blast. More attention should be paid to the research and application of plants with multiple resistance genes.

Key words： indica rice； blast； resistance gene； broad-spectrum resistance resource； South China

0 引言

【研究意義】稻瘟病是由真菌[Mangnaporthe grisea （Hebert） barr]引起的一種世界性水稻病害，對水稻生產造成極其嚴重的危害（Zeigler et al.，1994；彭昌家等，2015）。近年來，稻瘟病對我國水稻造成的減產平均每年約44.6萬t（劉萬才等，2016），尤其華南地區高溫高濕氣候非常有利于水稻稻瘟病的流行，多次出現稻瘟病大面積暴發事件，嚴重危害我國糧食生產安全（朱小源等，2008，2010；何秀英等，2012）。培育抗病品種是目前防治稻瘟病最經濟有效的措施，而鑒定發掘廣譜高抗優異抗性資源是培育優良抗稻瘟病水稻品種的關鍵。【前人研究進展】已有研究表明，我國稻種資源中存在豐富的優良稻瘟抗源。韋燕萍等（2009）從1500份普通野生稻中鑒定出38份抗稻瘟病普通野生稻和18份抗瘟藥用野生稻；張月雄等（2011）對抗瘟絲苗、新銀占和BE621等3個抗稻瘟病品種的225份后代材料進行田間自然誘發鑒定，結果發現13份為1級抗性材料，118份表現中抗；謝倩鳳等（2015）從82份水稻地方種質材料中分析獲得寬抗譜材料11份、中等抗譜材料55份。除篩選優良抗源外，有關學者還對抗稻瘟病基因進行鑒定與評價。楊健源等（2008）研究表明，抗稻瘟病基因Pikh、Pi9和Pish對廣東稻瘟病菌表現廣譜抗性，且這些基因的聚合能提高水稻對稻瘟病的抗譜；歐陽冬梅等（2009）研究發現，攜帶抗稻瘟病基因Pibt（t）的Basmatic370突變體BTX對稻瘟病具有廣譜抗性；何秀英等（2012）研究發現，粵晶絲苗2號攜帶有隱性抗稻瘟病基因pi55（t），廣譜高抗七大類中國稻瘟病菌生理小種；顏群等（2012）從廣西普通野生稻中鑒定出稻瘟病廣譜抗性基因Pi-gx（t）；汪文娟等（2016）研究證實，華南地方稻種暹羅占含有廣譜抗瘟基因Pi50。【本研究切入點】由于稻瘟病病原菌豐富多樣的生理小種極易發生變異而導致抗性基因喪失抗性，因此在育種實踐中需要不斷發掘新的抗源，并對抗源所攜帶的抗病基因進行鑒定評價。【擬解決的關鍵問題】對52份華南地區常用秈稻親本進行稻瘟病人工接種抗性鑒定和抗稻瘟病基因分子標記檢測，篩選出適應華南生態條件的廣譜高抗種質資源，分析親本材料稻瘟病抗性與其所攜帶稻瘟病抗性基因間的關系，并對稻瘟病抗性基因的育種利用價值進行評價，為水稻稻瘟病抗性育種提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的52份秈稻親本材料均由國家水稻改良中心南寧分中心收集提供。

1. 2 稻瘟病抗性鑒定

參照顏群等（2012）的方法進行稻瘟病人工接種鑒定。接種所用的14株菌株來自5個生理小種：ZA1（1、3和5號），ZA9（4、8、14和15號），ZB1（11、13、17、18和19號），ZB5（12號），ZB9（16號）。親本材料種子經浸泡催芽后，點播于50 cm×35 cm×8 cm的育秧盤中，每盤18行，每行17粒發芽種子。幼苗2～3葉齡時移至接種箱進行噴霧接種，每盤接種40 mL含稻瘟病菌孢子3×105～4×105個/mL的懸浮液，然后置于黑暗條件下26 ℃保濕（相對濕度≥95%）培養24 h，再移至溫室，定期噴霧保濕。接種7～10 d后待感病親本出現典型病斑時，按Bonman等（1986）的標準調查病情，1～3級植株為抗病表型（R），4～5級植株為感病表型（S）。

1. 3 DNA提取及PCR擴增

采用CTAB法提取水稻葉片基因組DNA（Murray and Thompson，1980）。PCR反應體系20.0 μL：30 ng/μL基因組DNA 1.0 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 13.9 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，退火（退火溫度見表1）45 s，72 ℃ 1 min，共進行35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物經4.5%非變性聚丙烯酰胺膠電泳銀染檢測。所有擴增引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1. 4 抗稻瘟病基因檢測

利用表1所列引物對52份秈稻親本材料進行分析，根據檢測結果判斷稻株是否含有相關的稻瘟病抗性基因。YL155/YL87和YL183/YL87分別是抗病基因Pi-ta和感病基因pi-ta的特異檢測引物組合，YL155/ YL87能擴增出1024 bp產物說明含有抗病基因Pi-ta，YL183/YL87能擴增出1024 bp產物說明攜帶感病基因pi-ta（Jia et al.，2002，2004）。PibdomF/PibdomR是抗病基因Pib的特異引物，能擴增出365 bp的目的片段（Fjellstrom et al.，2004）。Lys145F/Lys145R是抗病基因pib的特異引物，能擴增出803 bp的目的片段（劉洋等，2008）。pB8-F/pB8-R是抗病基因Pi9的特異引物，能擴增出700 bp的目的片段（Liu et al.，2002）。通過檢驗特異引物能否擴增出預期DNA片段，即可判斷水稻植株中是否攜帶相對應的基因。Pi-km介導的稻瘟病抗性需要Pi-km1和Pi-km2兩個基因同時存在才能完成。Ckm1F/Ckm1R和Ckm2F/Ckm2R分別是Pi-km1和Pi-km2共顯性標記，預期產物分別是174 bp（R）/213 bp（S）和290 bp（R）/332 bp（S），兩者均能擴增出目的片段，表明存在抗病基因Pikm（Costanzo and Jia，2010）。Pi54 MASF/Pi54 MASR是Pi54共顯性標記，預期產物分別是216 bp（R）/359 bp（S）（Ramkumar et al.，2011）。

2 結果與分析

2. 1 廣譜抗性材料篩選結果

經人工接種鑒定，發現親本材料對稻瘟病病原菌5個生理小種14株菌株的平均抗性指數介于1.1～7.8（表2）。對14個菌株均表現為抗（R）的廣譜抗性材料有2份，分別是五山絲苗和黃軟占，抗譜達100.0%。另外，有2份寬抗譜材料（YR48和粵綜占），其抗譜均為92.9%。其他材料的抗譜介于0～42.9%。

2. 2 材料抗性比較結果

在52份親本材料中，恢復系材料22份，對14株菌株的平均抗性指數5.3；保持系材料16份，其平均抗性指數5.1；常規稻材料12份，其平均抗性指數4.2。經方差分析發現，恢復系與常規稻間的平均抗性指數存在顯著差異（P<0.05，下同），其他類型材料間的平均抗性指數無顯著差異（P>0.05）。

2. 3 生理小種的致病力

由表3可看出，ZA1生理小種包含3株菌株，在156個抗性鑒定反應中有23個表現為抗，抗性頻率為0.15。ZB1生理小種包含5株菌株，在260個抗性鑒定反應中有84個表現為抗，抗性頻率為0.32。ZB5生理小種只含有1株菌株，在52個抗性鑒定反應中有16個表現為抗，抗性頻率為0.31。ZA9生理小種包含4株菌株，在208個抗性鑒定反應中有32個表現為抗，抗性頻率為0.15。ZB9生理小種也只有1株菌株，在52個抗性鑒定反應中有6個表現為抗，抗性頻率為0.13。可見，ZA1、ZA9和ZB9生理小種較ZB1和ZB5生理小種表現出更強的致病力，具有較低的抗性頻率。

2. 4 抗性基因的頻率

利用設計的特異引物對52份秈稻親本材料的Pi54基因進行檢測（圖1），同時檢測Pi-ta、Pib、Pi-km和Pi9等4個稻瘟病抗性基因，結果表明，親本材料所攜帶的基因數介于0～3（表2）。在52份秈稻親本材料中，有22份攜帶Pi-ta基因，19份攜帶Pib基因，22份攜帶Pi54基因，3份攜帶Pi-km基因。Pi-ta和Pi54基因的出現頻率最高，均為0.42；其次是Pib基因，出現頻率為0.37；Pi-km基因的出現頻率較低，僅0.06。所有秈稻親本材料中均未檢測出Pi9基因。

2. 5 基因組合的分布與抗性

由表4可知，僅含Pi-ta基因的秈稻親本材料6份（11.5%），在84個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為5.1；僅含Pib基因的秈稻親本材料8份（15.4%），在112個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為5.5；僅含Pi54基因的秈稻親本材料4份（7.7%），在56個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為4.4；含雙基因Pi-ta+Pib的秈稻親本材料1份（1.9%），在14個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為4.9；含雙基因Pi-ta+Pi54的秈稻親本材料7份（13.5%），在98個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為5.3；含雙基因Pib+Pi54的秈稻親本材料2份（3.8%），在28個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為6.9；含雙基因Pi-ta+Pi-km的秈稻親本材料1份（1.9%），在14個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為3.9；含雙基因Pi54+ Pi-km的秈稻親本材料1份（1.9%），在14個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為5.5；含三基因Pi-ta+Pib+Pi54的秈稻親本材料7份（13.5%），在98個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為3.4；含三基因Pib+Pi54+Pi-km的秈稻親本材料1份（1.9%），在14個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為3.6。另外，有14份（26.9%）秈稻親本材料未能檢測出抗性目的基因，在196個抗性鑒定反應中的平均抗性指數為5.6。攜帶單基因Pi54的稻株抗性高于攜帶基因Pi-ta或Pib的稻株；攜帶Pi-ta+Pib和Pi-ta+Pi-km雙基因稻株較攜帶Pi-ta或Pib單基因稻株表現出更強的抗性，但攜帶Pi-ta+Pi54、Pib+Pi54和Pi54+Pi-km雙基因稻株較攜帶Pi-ta、Pib或Pi54單基因稻株表現出更弱的抗性；攜帶Pib+Pi54+Pi-km和Pi-ta+Pib+Pi54三基因稻株的抗性高于所有單基因或雙基因稻株。

3 討論

培育抗性品種是防治稻瘟病最經濟有效的途徑之一，但由于其病原菌生理小種的多樣性和易變性，極易導致抗性品種喪失抗性，因此，在稻瘟病抗性育種實踐中需要不斷鑒定發掘廣譜抗源。本研究從52份華南常用秈稻親本中篩選獲得廣譜抗性材料4份，其中2份抗譜為100.0%，另2份抗譜為92.9%，表明從適應華南生態條件的秈稻親本中發掘稻瘟病優良廣譜抗源具有可行性。本研究還發現，常規稻較恢復系和保持系表現出更高的稻瘟病抗性，常規稻與恢復系的平均抗性指數間差異達顯著水平。自20世紀80年代中后期以來，針對廣東常規秈稻稻瘟病抗性差的問題，育種和植保工作者協同攻關，利用國外稻瘟病優良抗源對品種進行改良，已培育出一批抗病優良品種（朱小源等，2003），這些抗病優良品種對于華南常規稻品種改良有重要意義。此外，目前我國南方部分省（區）水稻品種審定委員會對新育成品種的抗稻瘟病性實行一票否決（張月雄等，2011）。可見，新形勢迫切要求育種工作者繼續加強廣譜優良抗源的發掘鑒定和創新利用研究。

Pi-ta、Pib、Pi54、Pi-km和Pi9等5個基因能介導水稻對稻瘟病的廣譜抗性，而基因特異分子標記的開發極大提高了廣譜抗性基因的育種利用效率（Jia et al.，2002，2004；Liu et al.，2002；Fjellstrom et al.，2004；劉洋等，2008；Costanzo and Jia，2010；Ramkumar et al.，2011）。其中，Pi-ta基因被認為是高頻率基因，而Pib是低頻率基因（楊杰等，2011；李進斌等，2012；謝倩鳳等，2015）。本研究發現在52份親本材料中Pi-ta基因出現的頻率最高（0.42），與李進斌等（2012）的研究結果相似；Pib和Pi54基因也具有較高的出現頻率，分別為0.33和0.39。Pi-km屬于稀有基因，攜帶該基因的材料較少（謝倩鳳等，2015）；Pi9基因來自小粒野生稻（Oryza minuta），對稻瘟病具有廣譜抗性（Liu et al.，2002）。本研究利用Pi9基因的特異引物pB8對秈稻親本材料進行擴增，但未檢測到該廣譜抗性基因。抗性比對分析結果表明，攜帶單基因Pi54的稻株抗性高于攜帶基因Pi-ta或Pib的稻株，因此應重視該基因的育種利用；攜帶Pi-ta+Pib和Pi-ta+Pi-km雙基因稻株較攜帶Pi-ta或Pib單基因稻株表現出更強的抗性，但攜帶Pi-ta+Pi54、Pib+Pi54和Pi54+Pi-km雙基因稻株較攜帶Pi-ta、Pib或Pi54單基因稻株表現出更弱的抗性，其原因可能是抗稻瘟病基因數量較多，本研究僅分析其中的5個抗性基因，稻株抗性是否還受到其他未檢測抗稻瘟病基因的調控，尚有待進一步探究。范方軍等（2014）研究發現，稻株同時存在Pib、Pi54和Pi-km基因時對稻瘟病抗性得到明顯提高。本研究也發現，攜帶Pib+Pi54+Pi-km和Pi-ta+Pib+Pi54三基因稻株的抗性高于所有單基因或雙基因稻株，進一步說明多個抗性基因聚合能有效提高稻株對稻瘟病不同生理小種的抗性。

4 結論

華南常用秈稻親本材料中存在著優良的稻瘟病廣譜抗源，可利用這些抗源拓寬育種材料的遺傳背景，培育抗病優良品種。多個抗性基因聚合能有效提高稻株對稻瘟病不同生理小種的抗性，在育種實踐中應加強多基因聚合材料的創制和利用研究。

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（責任編輯 蘭宗寶）