低溫脅迫下苦瓜幼苗差異蛋白的表達與分析

黃玉輝　梁家作　黃熊娟　馮誠誠　黃如葵　陳小鳳　劉杏連　陳振東　秦健

摘要：【目的】尋找與苦瓜苗期耐低溫表達調控相關的蛋白，深入了解苦瓜抗低溫機理，為下一步開展苦瓜耐低溫分子基礎研究及苦瓜耐低溫育種打下基礎。【方法】以耐冷型MC108和冷敏型MC6苦瓜品種為材料，運用雙向電泳技術分析低溫脅迫（8 ℃低溫脅迫72 h）下苦瓜苗期葉片蛋白質差異變化。【結果】對2-DE圖譜分析發現，冷敏型MC6和耐冷型MC108苦瓜品種間共存在82個差異蛋白點，其中，39個蛋白點上調，36個蛋白點下調，2個新增蛋白點，5個消失蛋白點；對其中24個表達量變化明顯的蛋白質點進行MALDI-TOF-TOF/MS 分析，經數據庫搜索匹配，鑒定出5個未知蛋白和14個功能蛋白，這些蛋白涉及細胞防御、自由基清除、光合作用、基礎代謝、蛋白降解等多個功能類別。【結論】在逆境脅迫下苦瓜可通過調節多種蛋白表達來適應外界溫度的變化。

關鍵詞： 苦瓜；低溫脅迫；差異蛋白；表達

中圖分類號： S642.5 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）04-0594-07

Abstract：【Objective】In the present study， the proteins related to cold resistance regulation of Momordica charantia L. at seedling stage were searched for so as to explore mechanism of resistance to low temperature and laid foundation for M. charantia L. cold resistance molecule research and cold resistance variety breeding. 【Method】Cold-susceptible M. charantia L. MC6 and cold-resistant M. charantia L. MC108 were taken as materials. Difference of proteins in M. charantia L. leaves at seedling stage under low temperature stress（8 ℃ for 72 h） was analyzed by two dimensional electrophoresis. 【Result】2-DE map indicated that there were 82 differential protein spots between cold-susceptible M. charantia L. MC6 and cold-resistant M. charantia L. MC108. Among these protein spots， thirty-nine up-regulated， thirty-six down-regulated， two were newly added and five disappeared. MALDI-TOF-TOF/MS analysis was conducted on 24 proteins spots with obvious expre-

ssion difference. Through searching and matching in database， five unknown proteins and fourteen functional proteins were detected. These proteins were involved in cytophylaxis， radicals scavenging， photosynthesis， basic metabolism and protein degradation. 【Conclusion】Under stress， M. charantia L. can adapt to the temperature variation through regulating multiple proteins.

Key words： Momordica charantia L.； low temperature stress； differential protein； expression

0 引言

【研究意義】苦瓜（Momordica charantia L.）起源于東南亞的熱帶地區，為葫蘆科苦瓜屬，短日照、冷敏性蔬菜，營養豐富，尤其維生素C含量位列瓜果類蔬菜之首，具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抗菌及提高人體免疫力等功效，為我國城鄉居民菜、藥兼用。為了實現苦瓜周年供應和全面提高苦瓜生產的經濟效益，近年來各地大力發展苦瓜四季栽培技術，但由于我國大部分地區冬春季節氣溫低，嚴重制約了苦瓜的全年生產，其中廣西大多數地方常出現冬季寒露風和春季低溫天氣，尤其2～4月冷空氣南下頻繁，與南方暖濕氣流交匯，形成連續或斷續的低溫陰雨天氣，導致苦瓜等喜溫性蔬菜落花落果而減產或絕收，嚴重阻礙了廣西苦瓜產業的可持續發展。因此，突破低溫對苦瓜正常生長的危害是實現苦瓜全年生產，尤其是反季節生產的關鍵所在。【前人研究進展】雙向電泳作為一種快速、簡單、高效分離蛋白點的方法近年來已成為研究植物對逆境脅迫應答的重要手段。目前，已研究發現逆境脅迫下誘導的脅迫蛋白、熱激蛋白和抗病蛋白等在抗脅迫中發揮著重要作用。在低溫脅迫應答方面，Griffith等（1992）從冷適應冬麥質體中分離到具有較高抗凍活性的抗凍蛋白（AFS），這種蛋白與病原相關蛋白相似，靠積累突變進化形成結合冰的能力。Hincha等（1997）從甘藍葉片中純化出一種具有冷保護活性的28.5 kD的“沸騰—穩定”蛋白（低溫保護素），其冷保護活性與一個冷誘導的7 kD糖蛋白（熱激蛋白）有關。李銳等（2010）通過蛋白雙向電泳和質譜分析，研究了低溫脅迫下棉花幼苗蛋白質的含量變化，結果表明，不同品種棉苗在低溫脅迫前后表達量存在明顯差異，得到了30個蛋白指紋圖譜，其中逆境蛋白占20%。隨著蛋白質組學技術的廣泛應用，更多與低溫脅迫響應相關的蛋白在水稻、大豆、豌豆、油菜、玉米、小麥、香蕉和茭白等植物中被發現（阮松林等，2006；王巍等，2011；楊猛等，2013；蒼晶等，2014；金曄等，2015；張春等，2015；周國華等，2016），這些逆境蛋白可增強細胞對各種逆境的抵抗能力，進而提高植物的生存能力。【本研究切入點】目前，有關低溫脅迫下苦瓜差異蛋白的研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】以耐冷型MC108和冷敏型MC6苦瓜品種為材料，利用蛋白質組學技術，比較不同耐冷苦瓜材料在低溫脅迫下葉片蛋白質組的變化，以深入了解苦瓜抗低溫機理，為今后開展苦瓜耐低溫分子基礎研究及苦瓜耐低溫育種打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試耐冷型MC108和冷敏型MC6苦瓜品種分別來自山東和廣西。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 供試苦瓜種植 采用室外盆栽播種，正常水肥管理，待苦瓜幼苗長至4葉1心時，處理在光照培養箱中8 ℃低溫脅迫72 h，空白對照在常溫繼續培養。每處理植株15株，3次重復。

1. 2. 2 苦瓜葉片全蛋白提取 苦瓜葉片蛋白提取參考Saravanan和Rose（2004）的方法并稍加改進：將1 g苦瓜葉片（加20% PVPP）液氮研磨成粉，加入10 mL提取液[含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 7.5），50 mmol/L EDTA（pH 8.0）， 0.7 mol/L蔗糖，0.1 mol/L KCl]和10 mL Tris飽和酚，充分混勻后低溫放置30 min；4 ℃下10000 r/min離心15 min，棄上清液，加入等體積的提取液，充分混勻后于低溫放置30 min；4 ℃下10000 r/min離心15 min，棄上清液，加入5倍體積的醋酸銨甲醇溶液對蛋白進行沉淀，充分混勻后-20 ℃沉淀過夜；加入5 mL丙酮對蛋白進行洗滌，用移液器（1 mL）反復吹打均勻后，4 ℃下10000 r/min離心15 min；重復操作1次；棄上清液后，室溫干燥，-80 ℃保存備用。

1. 2. 3 雙向電泳（2D-PAGE） 第一相等電聚焦電泳（IEF）：計算蛋白上樣量，銀染用120 μg，考染用800 μg；按濃度取蛋白上清液，加入水化液（含8 mol/L Urea，2% CHAPS，18 mmol/L DTT，0.5% IPG Buffer pH 3～10，0.002%溴酚藍），選用24 cm pH 4～7膠條進行水化；采用GE ETTAN IPGPHOR 3等電聚焦系統進行等電聚焦，電泳參數為300 V 30 min、700 V 30 min、1500 V 1.5 h、9000 V 3.0 h、9000 V 4.0 h。第二相聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：用垂直電泳系統制備聚丙烯酰胺凝膠，分離膠濃度為12%，電泳參數為80 V 30 min左右，之后為200 V 5 h，直至溴酚藍前沿離膠下沿0.5 cm處停止電泳。電泳結束后取出凝膠切角標記并進行銀染顯色。

1. 2. 4 凝膠掃描、圖譜分析和質譜鑒定 凝膠銀染后用掃描儀（Image scanner）掃描，分辨率為300 dpi，獲取凝膠圖像。用ImageMaster 2D Platinum 5.0（GE）對凝膠圖譜進行分析。建立4組凝膠圖像分析組，組1為MC6空白對照（MC6-CK），組2為經低溫處理的冷敏型苦瓜種質材料MC6（MC6-CL），組3為MC108空白對照（MC108-CK），組4為經過低溫處理的耐冷型苦瓜種質材料MC108（MC108-CL），每處理3張重復雙向圖譜，分別進行組內和組間蛋白質點表達豐度比較，獲得蛋白質點差異表達變化信息。差異蛋白點的篩選標準為豐度變化差異量為150%的點。

選取本研究中高清晰度、重復性好、豐度變化在150%以上的24個蛋白差異點進行MALDI-TOF-TOF串聯質譜分析。將獲得完整的肽指紋圖譜測定結果通過NCBInr和SWISSPROT數據庫搜索比對；物種檢索選擇All，數據檢索方式選擇Combined；不完全裂解位點的最大允許值為1個；質量誤差范圍為50 mg/L。

2 結果與分析

2. 1 供試材料苗期耐冷性表現

經低溫處理后冷敏型苦瓜MC6幼苗功能葉片出現水漬斑并連成大片，部分功能葉片失水萎蔫，新生葉片皺縮；耐冷型苦瓜MC108新生葉片稍微卷曲、葉色正常，表明MC108具有良好的低溫耐受能力（圖1）。

2. 2 苦瓜葉片蛋白2-DE圖譜分析

利用ImageMaster 2D Platinum 5.0（GE）分析在低溫脅迫下冷敏型和耐冷型苦瓜材料幼苗葉片的雙向電泳圖譜，結果（圖2）表明，銀染后圖譜上差異蛋白點具有良好的重復性和匹配率，可用于后續分析。每個蛋白雙向電泳凝膠圖譜上均檢測到2100個左右的有效蛋白點。經軟件統計分析表明，與對照組比較，冷敏型MC6品種圖譜存在43個顯著差異的蛋白點，其中12個蛋白點上調，30個蛋白點下調，1個消失蛋白點；耐冷型MC108苦瓜品種圖譜存在39個顯著差異的蛋白點，其中27個蛋白點上調，6個蛋白點下調，2個新增蛋白點，4個消失蛋白點。

2. 3 差異蛋白點質譜分析和數據庫鑒定結果

對選出的MC6-CK～MC6-CL組及MC108-CK～

MC108-CL組中高清晰度、重復性好、豐度變化在150%以上的24個蛋白差異點（表1）進行質譜分析，并將獲得完整的肽指紋圖譜測定結果通過數據庫搜索比對，成功鑒定出19個蛋白質（表2），包括5個未知蛋白和14個功能蛋白，結合數據庫檢索和相關文獻報道，對成功鑒定的19個蛋白質進行功能分析，結果顯示，這些相關蛋白參與細胞防御、自由基清除、光合作用、基礎代謝、蛋白降解等多個生理過程。

3 討論

3. 1 關于低溫脅迫苦瓜S-腺苷甲硫氨酸合成酶上調的應激功能

S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）是催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成的主要酶類，而SAM是多胺、乙烯和谷胱甘肽等生物合成的前體。近年來的研究表明，多胺（陳坤明和張承烈，2000；關軍鋒等，2003；楊建昌等，2004）、乙烯（Yang and Hoffman， 1984）和谷胱甘肽（Estcrbhauer and Grill，1978；Sehupp and Rennenbrry，1988；Salt and Rauser，1995）在植物受到干旱、化學、病蟲害等逆境脅迫下可提高植物抗逆性，推測SAMS在植物抗逆中發揮重要作用。Mathur等（1992）研究發現擬南芥、水稻中SAMS基因的表達在水分脅迫時表達量增加。余濤等（2004）發現SAMS基因的表達受氧化脅迫及高溫脅迫的誘導，并從煙草中克隆獲得SAMS基因。本研究結果顯示，冷敏型MC6苦瓜幼苗在低溫脅迫下SAMS基因無明顯變化，而耐冷型MC108苦瓜幼苗的SAMS基因受低溫脅迫誘導呈上調表達，有利于促進大量合成多胺和谷胱甘肽以抵御低溫脅迫，從而減少外界逆境脅迫的傷害。

3. 2 關于低溫脅迫苦瓜GDP-甘露糖-3，5-表異構酶上調的應激功能

植物中外界環境脅迫會引起氧化猝發，造成活性氧過度積累，從而對植物造成一定傷害。活性氧對植物的細胞毒性很強，如果沒有足夠的保護機制，它們可以與蛋白質、脂質和核酸反應而滅活重要的防御系統，從而導致植物不可挽回的代謝功能障礙甚至死亡（Hossain et al.，2011）。L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，AA）作為細胞內的一種還原物質，可通過逐級供給電子而轉變為半脫氧抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的過程清除體內超負氧離子、有機自由基和有機過氧基等，保護植物體免受活性氧的危害。而GDP-甘露糖-3，5-表異構酶（GDP-mannose-3'，5'-epimerase，GME）是催化GDP-D-甘露糖合成AA的主要酶類。本研究以8 ℃處理苦瓜幼苗72 h，冷敏型MC6苦瓜幼苗的GME表達量變化不明顯，而耐冷型MC108苦瓜幼苗的GME表達量是對照的2.3倍，表達量明顯上調。與此相似的研究也有一些報道，杜盈等（2005）分別在15、10和5 ℃不同低溫條件對2個水稻的GME基因進行低溫處理24 h，發現OsGME1基因表達量上升，而OsGME2基因沒有明顯變化；王江英等（2012）4 ℃處理棉花幼苗8 h后，發現GME表達量上調。

3. 3 關于低溫脅迫苦瓜26S蛋白酶體調節亞基11上調的應激功能

26S蛋白酶體包括20S的核心結構和兩端19S的調控結構，后者又分為ATP和非ATP依賴的多亞基構成。其依賴泛肽ATP降解目標蛋白，是真核細胞選擇性降解蛋白質的一種途徑，即泛肽途徑（Fu et al.，1999）。泛肽途徑對于清除異常蛋白質維護細胞的穩定性具有重要作用，成為植物應對非生物脅迫的一種重要調控途徑（Lommel et al.，2000；Peng et al.，2001）。本研究發現，在低溫脅迫下有一個蛋白點被鑒定為26S蛋白酶體調節亞基11，可能是26S蛋白酶體的組成部分，在耐冷型MC108苦瓜葉片中表達量上調，推測可能是耐冷型苦瓜MC108對低溫脅迫的一種應激響應機制。

3. 4 關于低溫脅迫苦瓜鐵蛋白上調的應激功能

鐵蛋白在低溫、干旱、病蟲害等脅迫條件下受環境信號的誘導而積累（Lobréaux and Briat，1991）。當植物處于逆境脅迫條件下時，氧化脅迫即占主要地位，抗氧化作用的防御能力減弱，由鐵介導的自由基增強，導致代謝失調、脂肪過氧化、蛋白質分解和DNA損傷（習陽等，2003）。由于鐵蛋白是一種以穩定的形式專門儲存鐵的蛋白質，因此其對植物抵抗逆境脅迫有重要作用。本研究發現，在低溫脅迫下，冷敏型苦瓜MC6鐵蛋白表達量下調，而耐冷型苦瓜MC108鐵蛋白表達量上調，推測耐冷型苦瓜MC108鐵蛋白表達量增加與苦瓜耐冷性增強對低溫的適應性反應有關。

本研究初步在蛋白質水平上揭示了苦瓜幼苗在低溫脅迫下的差異蛋白表達情況，所涉及的差異蛋白只是苦瓜蛋白質組中的一小部分，更多的低溫脅迫響應蛋白和基因表達機制有待深入研究。對已獲得的抗性相關蛋白，需要進一步應用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術克隆相關基因并進行Western blottling驗證，以確定其功能。在獲得的差異蛋白點中，并不是所有蛋白點都能成功檢測，可能是由于差異蛋白為逆境過程的低豐度蛋白，且分離過程中可能會丟失蛋白；也有可能是受限于膠條pH范圍、凝膠濃度和規格及蛋白提取純度等原因。另外，在本研究中苦瓜葉片蛋白表達量因材料不同而發生了相應變化，其原因可能是不同苦瓜材料對應激響應的機制與應急應答能力不同。

4 結論

應用差異蛋白質組學方法分析耐冷型和冷敏型苦瓜材料葉片低溫處理后的差異蛋白，從2-DE凝膠上均檢測到清晰且重復性好的蛋白質點均超過2100個，共獲得表達量差異在150%以上的差異蛋白75個。選取其中24個差異表達蛋白進行串聯質譜鑒定，將差異蛋白點獲得完整的肽指紋圖譜測定結果通過MASCOT數據庫搜索比對，共成功鑒定出19個蛋白點，這些功能蛋白參與細胞防御、自由基清除、光合作用、基礎代謝、蛋白降解等多個生理過程。通過對低溫脅迫下苦瓜差異蛋白的研究可知，苦瓜抗冷性能可通過相關蛋白表達量的調控來實現。

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（責任編輯 麻小燕）