六堡茶中金花菌的分離與鑒定

歐惠算　鄧旭銘　張靈枝　張均偉　馬士成　邱瑞瑾

摘要：【目的】研究鑒定六堡茶中的金花菌，為推動六堡茶產業發展提供一定的理論基礎?！痉椒ā坎捎闷桨逋坎挤叭c接種法從梧州中茶茶廠2015年11月生產的六堡茶中分離純化金花菌，以傳統的形態學觀察法觀察菌落特征，利用光學顯微鏡觀察菌絲、分生孢子等結構特征，再結合分子生物學方法對分離獲得的菌株進行DNA序列分析，并通過ITS序列進行同源性搜索比對和系統發育進化樹分析?！窘Y果】分離獲得一株金花菌，命名為LB-1。LB-1菌株的形態特征與散囊菌屬很相似，主要表現為：菌落呈金黃色、有同心環、有放射性脊等，其ITS序列與阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）的同源性達99%，進一步確定LB-1菌株為阿姆斯特丹散囊菌。【結論】從六堡茶中分離獲得的金花菌LB-1為散囊菌屬中的阿姆斯特丹散囊菌。在六堡茶加工中，可為LB-1菌提供適宜的環境，促進其大量繁殖，以增強六堡茶的保健功效。

關鍵詞： 六堡茶；金花菌；阿姆斯特丹散囊菌；分離；鑒定

中圖分類號： S571.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）04-0658-05

Abstract：【Objective】Jinhua fungus in Liupao tea was identified in order to provide theoretical basis for Liupao tea industry development. 【Method】Spread-plate method and three-point inoculation method were adopted to isolate and purify Jinhua fungus from Liupao tea produced by China Tea（Wuzhou） Factory in November， 2015. The colony characteristics were observed by traditional morphology observation method， and the structures like hypha and conidium were observed via optical microscope. Then DNA sequence analysis for strain isolated was conducted combining molecular biology method， and homology searching and comparison via ITS sequence and phylogenetic tree analysis were carried out. 【Result】One strain of Jinhua fungus was isolated and named LB-1. The morphological characteristics of LB-1were similar to those of Eurotium： golden colony， concentric rings， radioactive ridge， etc. The homology of its ITS sequence to Eurotium amstelodamiwas 99%. Therefore， LB-1 was identified as E. amstelodami. 【Conclusion】Jinhua fungus LB-1 is isolated from Liupao tea， and identified as E. amstelodami in Eurotium. During processing of Liupao tea， the producers can create suitable environment for LB-1 and promote the mass reproduction of LB-1， so as to enhance the health care effects of Liupao tea.

Key words： Liupao tea； Jinhua fungus； Eurotium amstelodami； isolation； identification

0 引言

【研究意義】六堡茶因原產于廣西梧州市蒼梧縣六堡鄉而得名，屬于黑茶類，為后發酵茶。六堡茶特殊的加工工藝：殺青—初揉—堆悶—復揉—干燥—篩選—拼配—渥堆—初蒸焗堆—復蒸—涼置—陳化（DB45/T 479-2014），使其具有獨特的品質特征：干茶色澤黑褐光潤，湯色紅濃似琥珀，滋味醇和甘爽，潤滑可口，有檳榔味，葉底紅褐色，耐沖泡，以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱，耐于久藏，越陳越好（何志強，2007）。近年來，以普洱茶為代表的黑茶類在市場上掀起了熱潮，黑茶中微生物鑒定也成為海內外學者研究的熱點，出現了大量關于茯磚茶中金花菌的研究報道，如陳椽（1984）提出，金花菌能夠分泌淀粉酶催化茶葉中的淀粉轉化為單糖，還可分泌氧化酶催化多酚類化合物氧化，從而消除茶葉枝梗的粗老氣味，使茶湯呈紅棕色，滋味也更加醇厚并帶有甜味；楊撫林（2005）在體外模擬胃液的試驗中發現金花菌發酵液對胃蛋白酶活性有促進作用，但對脂肪酶活性有抑制作用；鄧放明等（2007）研究發現黑茶中的金花菌具有降脂、減肥、促進消化、改善人體腸道的功效，其發酵產物胞外多糖還具有抑制腫瘤的功效。人們通常根據金花菌的質量和數量來判斷茯磚茶品質的好壞，因此，研究六堡茶金花菌，對改善六堡茶的加工工藝、促進六堡茶產業發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】黑茶中的微生物種類繁多且對茶葉的影響較大。近年來，關于金花菌的鑒定研究較多并已取得較大進展。黃浩等（2010）從湖南益陽茶廠2008年生產的金湘益磚茶中分離純化得到一株金花菌，在光學顯微鏡下觀察菌株形態、在掃描電鏡下觀察菌株的子囊孢子（有性階段）和分子孢子（無性階段），同時結合DNA測序，在分子水平上對分離菌株進行鑒定，確定該菌株為冠突散囊菌。彭曉赟等（2011）對湖南地區茯磚茶上金花菌的菌落特征和形態特征進行了研究，并運用掃描電鏡觀察了其子囊孢子和分生孢子的發育過程，鑒定其為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。宋偉（2011）從黑磚茶中分離純化獲得5種真菌，經過形態學觀察及分子鑒定確定5種真菌分別為：塔賓曲霉、阿姆斯特丹散囊菌、斑點青霉、冠突散囊菌和泡盛曲霉，其中的阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）和冠突散囊菌屬于金花菌。徐書澤（2014）利用高通量測序技術對梧州茶廠4個成品六堡茶中的真菌多樣性和菌落結構進行分析，通過傳統形態學鑒定結合真菌分子鑒定技術從中分離鑒定得到5個屬18個種的微生物，其中的散囊菌屬為阿姆斯特丹散囊菌。胡謝馨等（2016）從茯磚茶中分離出一株優勢菌株LS1，經形態學觀察及ITS-5.8S rDNA序列分析，鑒定為冠突散囊菌?！颈狙芯壳腥朦c】前人對黑茶類金花菌的研究主要集中在普洱茶和茯磚茶上，對廣西六堡茶金花菌的研究報道較少?！緮M解決的關鍵問題】采用平板涂布法從梧州中茶茶廠2015年產的六堡茶中分離金花菌，采用三點接種法對分離獲得的金花菌進行培養，探索適宜其生長的培養基，通過運用光學顯微鏡觀察菌落形態、參照真菌鑒定手冊及結合現代分子生物學進行DNA測序，從分子水平上對六堡茶金花菌進行鑒定，為揭示六堡茶的安全性、提高六堡茶的品質及促進六堡茶產業的發展提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試茶樣：2015年11月剛壓好的六堡茶（梧州中茶茶廠提供）。培養基：分離純化培養基（PDA培養基）、鑒定培養基（察氏瓊脂培養基、20%蔗糖察氏瓊脂培養基）。

1. 2 六堡茶金花菌分離與純化

分離：稱量10 g茶樣于250 mL三角瓶中（含玻璃珠），加入90 mL無菌蒸餾水，于振蕩器中振蕩15 min，即制成10-1倍的稀釋菌懸液；在超凈工作臺上吸取1 mL的10-1菌懸液加入到裝有9 mL無菌蒸餾水的試管中，得到10-2的稀釋菌懸液，以此類推，依次稀釋至10-7。分別取1 mL各稀釋濃度的菌懸液在PDA培養基上，用無菌三角玻璃棒劃“十”和“（）”的手法均勻涂布，每個濃度設3個重復，于恒溫培養箱內28 ℃倒置培養7 d。

純化：用針挑取少許金黃色菌絲，用劃線法在PDA和察氏培養基上進行多次分離培養，直至菌落的形態相同，將得到的金花用試管斜面培養基培養后保存于4 ℃冰箱中。

1. 3 金花菌形態學觀察

將4 ℃保存的菌種取出，于28 ℃下活化培養24 h，用三點接種法分別將菌株接種于察氏瓊脂培養基和20%蔗糖察氏瓊脂培養基上，于28 ℃恒溫培養箱倒置培養，每天觀察、記錄菌落的生長情況。

采用插片法，將滅菌的蓋玻片呈45～50°角插入20%蔗糖察氏瓊脂培養基，待菌絲擴展至蓋玻片，取出將其放在載玻片上（粘有菌絲的一面朝上），在光學顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1. 4 金花菌分子鑒定

菌株DNA提?。河脛澗€法培養菌株6 d后，用已滅菌小鐵鏟將菌絲刮下置于已滅菌的研缽中，加入液氮迅速將菌絲研磨成粉末，按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒的說明進行操作。

PCR擴增引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAG

GAAGTAA-3'）；ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG

C-3'）。PCR反應體系25.0 μL：DNA模板1.5 μL，ExTaq酶（TaKaRa公司）12.5 μL，IFS1F引物0.5 μL，IFS4引物0.5 μL，加無菌水至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成像系統拍照。將PCR純化產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將得到的序列在NCBI數據庫中使用BLASTn進行同源序列比對，通過MEGA 6.0構建系統發育進化樹。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）構建進化樹，用自展檢驗（Bootstrap）方法進行驗證，隨機搜索設置為1000。

2 結果與分析

2. 1 金花菌的形態學特征

從六堡茶中分離純化得到一株金花菌，命名為LB-1。采用三點法分別將LB-1菌株接種到察氏瓊脂培養基和20%蔗糖察氏瓊脂培養基上，結果顯示，菌落在察氏瓊脂培養基上生長緩慢，但在20%蔗糖察氏瓊脂培養基上生長較快，其生長速度為75 mm/14 d。菌落為絨狀，中間微隆起，整體呈金黃色，有同心環紋路，中間部位較邊沿更黃，黃色閉囊殼豐富，成熟后為黃褐色，菌落中心部位有長放射性脊，菌絲有隔，呈不對稱分枝，培養5 d左右其上分布暗灰綠色的分生孢子頭，分生孢子梗莖較長，分生孢子串生，為球形或近球形，大小為4.5～4.9 μm，表面粗糙，培養7 d左右，有大量成熟的分生孢子脫落在菌絲周圍（圖1、圖2）；菌落背面呈棕褐色，老后顏色變深，無脊光滑（圖1-b）。根據對金花菌菌落及光鏡的觀察結果，結合中國真菌志（齊祖同，1997），初步將LB-1菌株鑒定為散囊菌屬。

2. 2 金花菌的分子生物學鑒定

將PCR擴增測序得到的ITS序列（圖3）在NCBI數據庫中使用BLASTn進行同源性搜索比對，結果（表1）發現，在比對列表中居前十幾位相似度在97%以上的可培養菌株均為阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami），比對相似性均達99%，如將序列相似性在97%以上的基因克隆子定義為同一種物質，則分離的金花菌為阿姆斯特丹散囊菌。再進一步應用MEGA 6.0構建系統發育進化樹，結果（圖4）顯示，分離出的LB-1菌株與阿姆斯特丹散囊菌連在同一分支上，因此進一步確定LB-1菌株為阿姆斯特丹散囊菌。

3 討論

金花菌是茯磚茶的代表，人們常以金花菌的多少來衡量茯磚茶品質的好壞。黃浩等（2010）根據茯磚茶中金花菌株的表觀形態、光學顯微鏡、掃描電鏡特征和DNA序列分析，確認茯磚茶中的金花菌為冠突散囊菌（E. cristatum）。而胡治遠等（2011）通過分離比較不同茯磚茶中的優勢菌，得到15株散囊菌屬、8株冠突散囊菌、2株肋狀散囊菌、3株謝瓦散囊菌、1株蠟葉散囊菌和1株阿姆斯特丹散囊菌，說明茯磚茶中的金花菌具有多樣性。六堡茶經過渥堆和陳化，形成了獨特的品質特征，具有檳榔香味，并以金花普遍茂盛品質為佳。本研究在六堡茶中分離得到的金花菌經鑒定為阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）。毛彥等（2013）在梧州六堡茶中也分離得到一株金花菌，通過群體形態和個體形態研究，參照真菌分類鑒定手冊和序列同源性搜索比對，鑒定出六堡茶的金花菌為雪黃散囊菌；而陳然等（2016）選取多家梧州六堡茶龍頭企業生產的六堡茶產品進行真菌分析，結果得出不同廠家六堡茶產品的優勢菌種包括冠突散囊菌和謝瓦氏散囊菌等散囊菌屬真菌。以上兩個研究與本研究鑒定結果不一致，可能是由于試驗茶樣來自不同茶廠，在加工時漚堆的時間和溫度不同，導致成品茶中的金花菌種不同?？梢?，六堡茶中的金花菌也具有多樣性。

散囊菌屬是黑茶中的一類重要真菌，其對黑茶的品質口感、保健功效均有舉足輕重的作用。劉作易和秦京（1991）的研究結果表明，冠突散囊菌絲體富含15種氨基酸，其中包括所有的必需氨基酸。此外，有多篇文獻報道冠突散囊菌的抗氧化活性、抑菌效果及其對消化酶活性的影響等研究（楊撫林，2005；黃群等，2007a，2007b；李瑩，2014；葛永怡等，2015）。本課題組下一步將對分離鑒定出的阿姆斯特丹散囊菌進行更深入研究，探究其對六堡茶品質的影響，以及六堡茶抗氧化、促消化和降血脂等效果的作用機理，以期為六堡茶的生產加工、利用和發展打下一定的理論基礎。

4 結論

本研究在新生產的六堡茶中分離純化得到一株金花菌（LB-1菌株），運用光學顯微鏡觀察菌落的形態、參照真菌鑒定手冊并結合現代分子生物學進行DNA測序，通過ITS序列進行同源性搜索比對和系統發育進化樹分析，確認LB-1菌株為阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）。在六堡茶加工中，可為LB-1菌提供適宜的環境，促進其大量繁殖，以增強六堡茶的保健功效。

參考文獻：

陳椽. 1984. 制茶技術理論[M]. 上海：上?？茖W技術出版社.

Chen C. 1984. Theory of Tea Processing Technique[M]. Shanghai： Shanghai Science and Technology Press.

陳然，郝彬秀，田海霞，李頌，馬躍，王春玲. 2016. 六堡茶真菌分布淺析及金花菌篩選鑒定[J]. 食品科技，41（4）：19-23.

Chen R，Hao B X，Tian H X，Li S，Ma Y，Wang C L. 2016. Distribution of fungal strains and molecular identification of Eurotium cristatum in Liupao tea[J]. Food Science and Technology， 41（4）：19-23.

鄧放明，龔淑莉，楊偉麗. 2007. 冠突散囊菌胞外多糖生物活性高通量篩選試驗[J]. 食品與機械， 23（6）： 48-51.

Deng F M，Gong S L，Yang W L. 2007. Study on bioactivity of extra cellular polysaccharide of Eurotium cristatum by high through putscreening[J]. Food & Machinery， 23（6）： 48-51.

葛永怡，吳石平，譚玉梅，劉永翔，劉作易. 2015. 冠突散囊菌不同生長階段MAT基因的表達量變化[J]. 西南農業學報，28（6）：2730-2735.

Ge Y Y，Wu S P，Tan Y M，Liu Y X，Liu Z Y. 2015. Expression difference of mating type gene in different development stages of Eurotium cristatum[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，28（6）：2730-2735.

何志強. 2007. 弘揚六堡茶文化 做強六堡茶產業[J]. 中國茶葉，（4）： 32-38.

He Z Q. 2007. Carrying forward the Liupu tea culture and strengthening Liupu tea industry[J]. China Tea，（4）： 32-38.

胡謝馨，易有金，柏連陽，李高陽，周紅麗，周金偉，夏菠. 2016. 茯磚茶“金花”菌的分離、鑒定及轉化葛根產物研究[J]. 茶葉科學，36（3）：268-276.

Hu X X，Yi Y J，Bo L Y，Li G Y，Zhou H L，Zhou J W，Xia B. 2016. Research on separation， identification and transformation products transformed kudzu root of ‘Jinhua fungus[J]. Journal of Tea Science， 36（3）：268-276.

胡治遠，趙運林，劉素純，劉石泉，龍立平，彭曉赟，李燕子. 2011. 不同品種茯磚茶中優勢微生物的分離鑒定[J]. 江西農業學報， 23（12）： 60-64.

Hu Z Y，Zhao Y L，Liu S C，Liu S Q，Long L P，Peng X Y，Li Y Z. 2011. Isolation and identification of dominant microorganisms from different kinds of Fu-brick tea[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，23（12）： 60-64.

黃浩，劉仲華，黃建安，李適，李娟，吳楊，鄧婷婷，龔雪. 2010. “發花”散茶中“金花”菌的分離鑒定[J]. 茶葉科學，30（5）： 350-354.

Huang H，Liu Z H，Huang J A，Li S，Li J，Wu Y，Deng T T，Gong X. 2010. Isolation and identification of “Jinhua” fungi from the loose tea with “Fungus Growing”[J]. Journal of Tea Science，30（5）： 350-354.

黃群，陳林杰，李彥坡，車科. 2007a. 冠突散囊菌黑茶發酵液對消化酶活性影響的研究[J]. 微生物學通報，（5）： 917-920.

Huang Q，Chen L J，Li Y P，Che K. 2007a. Study on the effect of dark tea fermentation liquid with Eurotium cristatum on the activity of digestive enzyme[J]. Microbiology，（5）： 917-920.

黃群，李彥坡，陳林杰，車科. 2007b. 冠突散囊菌液態發酵過程中黑茶活性成分變化研究[J]. 食品科學，28（12）： 231-234.

Huang Q， Li Y P，Chen L J， Che K. 2007b. Study on changes of active components in dark tea during liquid fermentation by Eurotium cristatum[J]. Food Science，28（12）： 231-234.

李瑩. 2014. 冠突散囊菌化學成分及其抗氧化活性研究[D]. 北京： 北京中醫藥大學.

Li Y. 2014. Study the chemical composition and its antioxidantactivity on Eurotium cristatum[D]. Beijing：Beijing University of Chinese Medicine.

劉作易，秦京. 1991. “金花”菌與茯磚茶品質[J]. 貴州農學院學報，10（1）：79-82.

Liu Z Y，Qin J. 1991. “Jinhua” fungus and Fu-brick tea quality[J]. Journal of Guizhou Agricultural School，10（1）：79-82.

毛彥，黃麗，韋保耀，夏寧，滕建文. 2013. 廣西六堡茶“金花”菌的分離與分子鑒定[J]. 茶葉科學，33（6）： 556-561.

Mao Y，Huang L，Wei B Y，Xia N，Teng J W. 2013. Isolation and molecular identification of fungal colonization on LiuPao tea in Guangxi[J]. Journal of Tea Science，33（6）： 556-561.

彭曉赟，章衛民，劉淑云，雷存喜，周小梅，劉石泉，趙運林. 2011. 湖南地區茯磚茶中金花菌的分離鑒定[J]. 菌物研究， 9（3）：157-161.

Peng X Y，Zhang W M，Liu S Y，Lei C X，Zhou X M，Liu S Q，Zhao Y L. 2011. Isolation and identification of “Golden Flower” fungus in Fuzhuan tea from Hunan area[J]. Journal of Fungal Research， 9（3）：157-161.

齊祖同. 1997. 中國真菌志（第五卷） 曲霉及相關有性型[M]. 北京： 科學出版社.

Qi Z T. 1997. Flora Fungorum Sinicorum（VolumeⅤ）： Aspergillus and Related Teleomorph[M]. Beijing：Science Press.

宋偉. 2011. 黑磚茶真菌的分離鑒定及功能研究[D]. 長沙：湖南農業大學.

Song W. 2011. Research on isolation，identification and function of funguses in duck brick tea[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.

徐書澤. 2014. 六堡茶中真菌的多樣性分析[D]. 南寧：廣西大學.

Xu S Z. 2014. Fungal community analysis of Liu Pao tea[D].Nanning：Guangxi University.

楊撫林. 2005. 冠突散囊菌液體發酵工藝及其發酵液對消化酶活性影響的研究[D]. 長沙：湖南農業大學.

Yang F L. 2005. Studies on liquid fermentation technology of Eurotium cristatum and the effects of the fermentative liquor on digestive enzyme activities[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.

（責任編輯 麻小燕）