氯霉素對大型溞的急性和慢性毒性效應

胡婷婷 吳慧明 陳穎

摘要[目的]評價氯霉素對水生生物的生態風險。[方法]以大型溞為研究對象，探討不同濃度氯霉素對大型溞急性和慢性毒性。[結果]急性毒性試驗結果表明，氯霉素對大型溞的48 h-EC50值為175.846 mg/L，屬于低等毒性。21 d慢性毒性試驗中各濃度處理對大型溞生長繁殖相關指標有不同程度的影響，且子代出現了不同程度的畸形現象。[結論]該研究結果為氯霉素水生生態毒性評價提供理論依據。

關鍵詞氯霉素；大型溞；慢性毒性

中圖分類號S948文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）36-0052-03

Abstract[Objective]In order to evaluate the ecological risk to aquatic organism. [Method]The acute and chronic toxicity of Chloramphenicol under different concertration on Daphnia magna was conducted. [Result]Acute toxicity test indicated that Chloramphenicol had low acute toxicity against Daphnia magna， the 48 h-EC50 was 175.846 mg/L. The 21 d chronic toxicity results showed Chloramphenicol exposure can effect the indices of Daphnia magna growth and reproduction， even malformation. [Conclusion]The study can provide reference for the safety evaluation of Chloramphenicol.

Key wordsChloramphenicol；Daphnia magna；Chronic toxicity

近年來，越來越多的抗生素類藥物用于在醫療、畜禽和水產養殖業，由于機體代謝率低，抗生素難以被完全吸收。Kumar等[1]研究發現，40%～90%的抗生素會以母體或者代謝物的形式隨尿液或糞便排出體外，對生態環境產生毒害，最終影響人類健康。環境中抗生素大多數會進入水環境，直接對浮游動植物造成毒害[2-3]。目前，相關研究表明，各國家和地區地表水、地下水和飲用水的抗生素污染比較普遍[4]。Mellon等[5]在大型養殖場的污水處理池中檢測到紅霉素、羅紅霉素和磺胺甲惡唑。章強等[6]對上海市水環境中抗生素的種類及其污染水平進行調查，發現長江口水體中磺胺類和氯霉素類抗生素含量較高。

氯霉素是畜禽業和水產養殖業上廣泛使用的一種廣譜性抗生素，能抑制多種好氧和厭氧菌感染，會造成再生障礙性貧血、神經系統受損和灰嬰綜合征等不良副作用[7-8]。2002年我國農業部正式將氯霉素作為禁藥列出，但水產養殖中違規添加氯霉素的行為屢不見鮮。徐維海等[9]對珠江廣州河段水體中抗生素含量的檢測數據發現，枯季和洪季河水中氯霉素的含量分別為54～187和11～266 ng/L，檢出率達100% 。由此可見，水體環境中的氯霉素污染不容忽視。目前，其生態毒理學方面的研究也越來越多，但主要集中于氯霉素對哺乳動物的毒性研究，對水生生物非靶標生物的研究相對較少。大型溞（Daphnia magna）廣泛分布于淡水水域，因對環境變化敏感性高、繁殖周期短和易培養等優點在國際毒理學研究中常作為模式生物，被廣泛應用于化學物質的水生生態毒性研究[10-12]。筆者以大型溞為對象，研究不同濃度氯霉素暴露下的急性毒性和慢性毒性效應，旨在為抗生素的毒理學研究提供參考。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

氯霉素原藥（Fluka公司，純度>98%）；單道可調量程移液器（艾本德股份公司）；SMZ-140體視顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）；尼康Eclipse 80i顯微鏡（尼康公司）。

1.2試驗生物

大型溞為浙江大學農藥與環境毒理研究所引種的62 D.M純品系生物株，采用經曝氣的M4培養液培養（20±2 ℃，光照∶黑暗為16 h∶8 h），培養密度為每只溞50 mL 培養液，每2 d更換1次培養液，每天喂食小球藻。投餌密度2.0×105～3.0×105個/mL，每天監測小球藻密度。

1.3試驗方法

1.3.1急性活動抑制試驗。

挑取個體大、懷卵多、游泳能力強的母溞單獨培養，對產下的幼溞進行試驗（溞齡小于24 h）。根據預試驗結果，設置氯霉素濃度為0、30、60、120、240 mg/L，每個濃度20只溞，分成4組，每組5只幼溞，試驗期間不對受試溞進行投喂，分別于24、48 h后觀察并記錄幼溞的活動抑制情況[13]。

1.3.2慢性繁殖試驗。

慢性繁殖試驗參照OECD化學品測試準則“211”[14]，采用半靜態法，每隔48 h更換試驗溶液，每天投喂新鮮小球藻。根據急性活性抑制試驗結果設置4個試驗濃度，分別為48 h EC50的1/135、1/45、1/15和1/5（1.304、3.911、11.730、35.200 mg/L），另設空白對照組（CK）。在100 mL加蓋燒杯中加入50 mL溶液，1只幼溞，每個處理組20只幼溞。試驗期內每隔24 h觀察1次，新生的幼溞及時取出，并記錄母溞的第1次產溞時間、第1次產溞數，計算整個試驗期間的產溞次數、總產溞數、蛻殼次數、胎數、觀察后代畸形和死亡率，并于21 d在體視鏡下測量體長。采用Lotka方程∑lxmxe-rx=1計算內稟增長力（rm），其中lx為第x 天每只溞的存活率，mx為每只母溞在第x天的產溞數。

1.4數據處理

運用SPSS 19.0數據處理軟件中Probit模塊求得大型溞48 h-EC50，采用Scheffe檢驗法比較對照組與試驗組間各指標的差異。

2結果與分析

2.1急性活動抑制試驗結果

根據急性毒性的試驗結果，用SPSS 19.0統計軟件求得氯霉素對大型溞48 h-EC50為175.846 mg/L，95%置信區間為148.607 6～251.923 0 mg/L，劑量-效應方程為 y=7.254 3x-11.286 8（相關系數r=0.871 8）。Wolleenberger等[15]研究報道，土霉素48 h-EC50 約為1 000 mg/L，四環素對大型溞的48 h-EC50值為617.2 mg/L，金霉素對大型溞48 h-EC50值為137.6 mg/L[16]。由此可見，不同抗生素對生物的毒性差異很大。根據國家環保局的新化學物質危害評估準則[17]中的危害分級標準，確定氯霉素對大型溞低毒。

2.2慢性繁殖試驗

2.2.1

不同濃度氯霉素暴露下大型溞初次產卵時間和初次產卵數。

由表1可知，F0代及F1代恢復條件下的大型溞的初次產溞時間受氯霉素影響不明顯。F1代11.730 mg/L濃度組染毒條件下第1次產溞時間顯著（P<0.05）短于CK。氯霉素暴露下大型溞F0代、F1代染毒以及F1代恢復條件下第1次產溞數與CK差異不顯著。

2.2.2不同濃度氯霉素暴露下大型溞產溞數和產胎數。

由表2可知，氯霉素對F0代、F1代染毒以及F1代恢復條件下的大型溞產幼溞數均有影響。3.911 mg/L暴露條件下F0代產溞數顯著（P<0.05）高于CK，而其他濃度均未表現出顯著差異（P>0.05）。各處理F1代產溞數明顯低于F0代相應濃度的產幼溞數。F1代染毒試驗中，除1.304 mg/L濃度處理外，其余濃度處理的產溞數均顯著低于CK（P<0.05）。在F1代恢復試驗中，所有濃度處理的產幼溞數均顯著低于CK（P<0.05）。

21 d的暴露試驗，F0代CK的產胎數平均為7.87代，各染毒組與CK相比無顯著差異（P>0.05），而F1代產胎數均少于F0代相應濃度處理的產胎數。F1代恢復條件下大型溞的產胎數與CK相比均無顯著差異（P>0.05）。F1代染毒條件下11.730 mg/L濃度處理的產胎數最多。

2.2.3不同濃度氯霉素暴露下大型溞21 d體長和蛻皮次數。由表3可知，

低濃度暴露下F0代體長大于CK，F1代染毒組體長與CK比較，無顯著差異（P>0.05）。F1代恢復條件下，高于3.911mg/L濃度后體長與CK相比顯著減小（P<0.05）。F1代染毒組體長與F1代恢復組相比有所增加。不同濃度氯霉素處理的F0代和F1代大型溞的蛻殼次數差異不顯著（P>0.05）。

2.2.4不同濃度氯霉素暴露下大型溞的死亡率和內稟增長力。由表4可知，

染毒條件下F0代在21 d內均未死亡，但F1代的染毒和恢復試驗中均出現了個體死亡，即11.730和35.200 mg/L氯霉素暴露條件下F1代染毒組大型溞分別出現了5%和10%的死亡率，而F1代恢復組中1.304 mg/L濃度組出現了10%的死亡率。由此推斷，氯霉素染毒后產生的F1代溞對環境的適應力有所下降。

內稟增長力可反映種群增長的瞬時速率。根據表4中大型溞在不同濃度氯霉素暴露下F0代、F1代染毒及F1代恢復試驗中的死亡率，采用Lotka方法可計算得到不同處理大型溞的內稟增長率。由表4可知，氯霉素染毒對F0代大型溞的內稟增長影響不大。與CK相比，氯霉素染毒可降低F1代大型溞的內稟增長力，且存在一定的劑量效應關系。染毒條件下氯霉素對F1代大型溞的抑制作用隨著氯霉素濃度的升高而增強。由此可見，長期的氯霉素暴露會對大型溞種群的繁衍產生不同程度的影響。

2.2.5不同濃度氯霉素暴露下大型溞的后代畸形類型。由表5可知，

F0代僅在高濃度（35.200 mg/L）暴露下觀察到畸形的現象，如觸角不完整或發育不完全及完全流產。低濃度（3.911 mg/L）暴露下的大型溞僅在F1代出現完全流產現象，而F0和F1代恢復均未發現異常。劉曦薇等[18]通過研究氯霉素對斑馬魚早期發育的毒性，發現氯霉素對斑馬魚胚胎的自主運動、心跳及孵化能力均會產生不利影響，且胚胎和仔魚在氯霉素暴露條件下均表現了明顯的畸形特征；劉臻等[19]研究了3種抗生素對熱帶爪蟾胚胎發育的毒性，發現氯霉素可抑制熱帶爪蟾的生長及導致胚胎產生圍心腔水腫。

3結論

（1）綜上所述，氯霉素暴露下F0代大型溞未發現致死現象，但F1代大型溞出現死亡。而對于F1代恢復試驗，盡管大型溞在無毒培養基中進行恢復，也觀察到大型溞死亡的現象，且在恢復條件下1.304 mg/L最低濃度組的死亡率甚至與染毒條件下的35.200 mg/L最高濃度組相同，表明F0代大型溞暴露于不同濃度氯霉素后，會對F1代大型溞的行為造成不同影響。氯霉素暴露雖然對F0大型溞的首次產溞時間、首次產溞數、產胎數和蛻殼數影響不顯著，但能影響F0代大型溞的體長。F1代染毒和恢復試驗中均出現個體死亡，說明氯霉素染毒后產生的F1代溞對環境的適應力有所下降。此外，氯霉素暴露可顯著減少F1代染毒和恢復條件下母溞產溞數量，一定濃度的氯霉素可影響F1代生長。綜上所述，氯霉素不僅會影響F0代大型溞的正常繁殖和生長，還會影響F1代的溞生長和繁殖，導致F1代溞對氯霉素更為敏感。

（2）根據毒性分級標準，氯霉素對大型溞屬于低毒，但慢性毒性試驗中，雖然各處理母溞無死亡現象，但是母溞在產溞過程中，幾個處理均有幼溞死亡或畸形現象，故可推測氯霉素長期暴露會對大型溞產生不可逆的傷害。

（3）在自然環境中，大型溞是魚類和大型無脊椎動物的餌料，以浮游植物為食，在水生態系統起著重要作用，而污染物在高營養級生物體內會隨食物鏈的富集而濃度升高，這會對處在食物鏈最高等級的人類健康將會構成威脅。因此，要全面評價氯霉素對水生態系的安全，還必須結合其對食物鏈中不同等級生物的生態毒性進行綜合評價。

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