高效液相色譜—串聯質譜同時分析豬肉中四環素類和喹諾酮類抗生素殘留

甘沛明 鄧曉華 招鈺娟 梁雪琪 黎小鵬

摘要 [目的]建立豬肉中喹諾酮類和四環素類抗生素的同時分析方法。[方法]樣品經過與HLB固相萃取小柱凈化、洗脫，以高效液相色譜-串聯質譜儀使用多反應監測（MRM）離子模式進行定性、定量分析。[結果]以豬肉為基質，四環素類抗生素在加標濃度為2和5 μg/kg時，回收率為75.7%～88.7%，相對標準偏差為1.2%～5.6%（n=3），方法檢出限為0.4～1.5 ng/mL；喹諾酮類抗生素在加標濃度為2和5 μg/kg時，回收率為79.0%～90.5%，相對標準偏差為2.1%～6.3%（n=3），方法檢出限為0.5～2.0 ng/mL。[結論]該試驗所建立的方法可成功地應用于豬肉中目標抗生素殘留的分析。

關鍵詞 高效液相色譜-串聯質譜；喹諾酮類；四環素類；抗生素

中圖分類號 S851.34+7.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0076-03

Simultaneous Determination of Quinolone and Tetracycline Antibiotics Residues in Pork by HPLC-MS/MS

GAN Pei-ming，DENG Xiao-hua，ZHAO Yu-juan et al （Zhongshan Quality Supervision & Inspection of Agricultural Products，Zhongshan，Guangdong 528400）

Abstract [Objective] To establish a method for simultaneous determination of quinolone and tetracycline antibiotics in pork.[Method] Using HLB cartridge for purification and elution，the qualitative and quantitative analysis was performed by HPLC-MS/MS MRM ion model.[Result] Using pork as substrate，the recoveries and relative standard deviations （RSD，n=3） were 75.7%-88.7%，1.2%-5.6% for tetracycline at 2 and 5 μg/kg spiking levels and 79.0%-90.5%，2.1%-6.3% for quinolone at 2 and 5 μg/kg spiking levels，respectively.The detection limits were 0.4-1.5 ng/mL for tetracycline and 0.5-2.0 ng/mL for quinolone.[Conclusion] The method can be successfully applied to the survey of antibiotics in pork.

Key words HPLC-MS/MS；Quinolone；Tetracycline；Antibiotics

隨著畜禽、水產養殖業的快速發展，我國抗生素的用量和種類也在日益增長。動物性產品中抗生素的殘留不僅會引起食品安全問題，還會對環境帶來影響。大多數抗生素不能被動物腸胃完全吸收，有50%～70%以母體或代謝物的形式排出動物體外[1]，對生態系統的健康產生毒害，并通過食物鏈最終對人體的健康產生危害[2-7]。目前，畜禽食品中殘留抗生素對環境的污染和人類的危害已引起人們的高度重視。

為治療動物疾病和提高動物抗病能力，喹諾酮類和四環素類藥物被人們廣泛地應用于動物飼養過程中，從而造成肉類中抗生素藥物的殘留。人類通過不同途徑攝入后都會在體內蓄積，導致很多細菌產生了抗藥性，對人類的身體健康有相當大的危害[8-10]。目前，食品安全監督機構以及相關企業將這2類藥物均列為日常檢測項目，進行重點監控。

因此，筆者選擇常用的四環素類和喹諾酮類抗生素為研究對象，采用HLB固相萃取小柱進行凈化，高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）技術檢測，建立了動物性食品中高靈敏度的同時分析方法，并將所建立的方法應用于各種動物性食品的四環素類和喹諾酮類抗生素殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。1200-6410高效液相色譜串聯質譜儀，配有電噴霧離子（ESI）源，美國Agilent公司；Milli Q 凈化系統，默克公司；氮吹儀，杭州雪中炭公司；1/100 000天平，梅特勒托利多公司；1/10天平，賽多利斯公司；勻漿機，IKA公司；固相萃取裝置，美國Agilent公司；冷凍離心機，希格瑪公司。

1.1.2 主要試劑。四環素、金霉素、土霉素，氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星標準品，均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度均不低于90%；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸乙酯，默克公司；Plexa固相萃取柱（200 mg 6cc），美國Agilent公司；Mcllvaince-Na2EDTA緩沖液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉，分析純，廣州化學試劑廠。

1.2 標準品以及試劑配制

分別準確稱取3種四環素類標準品各5.000 0 mg，以甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混勻即得濃度為100 mg/L各標準物質儲備液，-20 ℃保存備用。

分別準確稱取4種喹諾酮類標準品各5.000 0 mg，以0.1%甲酸水+乙腈（1∶4）溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混勻即得濃度為100 mg/L各標準物質儲備液，4 ℃保存備用。

0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液：取磷酸二氫鈉7.8 g，用水稀釋至1 000 mL。

0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液：取磷酸氫二鈉17.9 g，用水稀釋至1 000 mL。

磷酸鹽緩沖溶液：取0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液190 mL，用0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液稀釋至1 000 mL。

Mcllvaince-Na2EDTA緩沖液：分別取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉39.2 g，用900 mL水稀釋，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至5.0，誤差小于0.2，用水稀釋至1 000 mL。

洗脫液：取甲醇150 mL，加乙酸乙酯150 mL、濃氨水6 mL，混勻。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 液相色譜條件。

色譜柱為Agilent Poroshell EC-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）；流動相如表1所示；柱溫45 ℃；流速為0.4 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.2 質譜條件。

電離方式為ESI+，檢測模式為多反應監測（MRM），毛細管電壓4 000 V，干燥氣流量10 mL/min，干燥氣溫度350 ℃，霧化器壓力2.76×105Pa，定性離子對、定量離子對及碰撞能量見表2。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取。

準確稱取試料5 g于50 mL離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液8 mL，渦旋1 min后超聲20 min，10 000 r/min、4 ℃ 離心5 min，取上清液到另一50 mL離心管中，殘渣用磷酸鹽緩沖溶液8 mL重復提取1次，合并上清液，混勻備用。

1.4.2 凈化。HLB萃取柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取備用液過柱。依次用水5 mL、20%甲醇水溶液5 mL淋洗，抽干5 min用洗脫液10 mL洗脫，收集洗脫液，于45 ℃水浴氮氣吹干，加入初始流動相1 mL渦旋1 min溶解殘留物。0.22 μm濾膜過濾，供測定。

2 結果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

選用HLB固相萃取小柱吸附是保證高效萃取效率的基礎。該試驗對比研究了C18萃取柱與HLB萃取柱對7種抗生素的富集效果。結果表明，HLB柱對7種抗生素具有較好的萃取效果，且重復性更好。因此確定HLB柱作為萃取柱。

2.2 工作曲線的線性范圍和方法的檢出限

在該試驗條件下標準溶液的濃度在10、20、50、100、200、400 ng/mL各取10 μL進樣，記錄色譜圖得出各種獸藥線性方程、相關系數，以最低濃度混合標準品逐步稀釋，進樣并分析S/N=3確定檢出限（LOD），結果見表3。

2.3 樣品的加標回收率及相關系數

取豬肉基底，添加2和5 μg/kg，按“1.4”前處理方法對樣品進行處理，每個質量濃度平行測定3份，考察方法的回收率以及重現性。在分析前添加至樣品中，對分析過程進行質量控制。從表4可以看出，在各加標水平上，豬肉中獸藥的加標回收率在75.7%～90.5%，相對標準偏差（RSD）在1.2%～6.3%。由此可見，所建立的方法有較好的重現性，回收率也完全符合要求。

3 結論

該研究采用SPE前處理法與LC-MS/MS聯用技術同時分析豬肉中的四環素類和喹諾酮類抗生素殘留。樣品經過HLB固相萃取小柱凈化、洗脫，建立了豬肉中四環素類和喹諾酮類抗生素同時分析的高靈敏多反應監測（MRM）離子模式進行定性、定量分析的方法。該方法以豬肉為基質做添加回收，豬肉中獸藥的加標回收率在75.7%～90.5%，相對標準偏差（RSD）在1.2%～6.3%。結果顯示，該前處理方法均符合國標要求。該試驗所建立的多殘留檢測方法大大地提高了工作效率，降低了分析成本，對動物性食品的安全衛生工作意義重大。

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