RNAi 3種分子加工機制研究進展

肖穩 周瑋

摘要 RNAi（RNA interference，RNA干擾）是一種高度保守的由小分子RNA介導的基因沉默過程。根據介導RNAi的小RNA長度以及結合Argonaute （AGO）蛋白家族成員的不同，將小RNA分為miRNA （microRNA ）、siRNA （small interfering RNA ）和piRNA （Piwi-interacting RNA ） 3類。根據近年來取得的研究進展，系統地闡述了這3類小RNA的基因組來源及其加工產生機制，歸納總結了這3類小RNA之間的區別和聯系，并結合當前RNAi應用于疾病治療存在的問題提出了自己的看法。RNAi機制的完善對于生物進化、生長發育及癌癥等重大疑難疾病治療具有重要的應用價值。

關鍵詞 RNAi； miRNA；siRNA；piRNA

中圖分類號 S188；Q78 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0133-04

Research Progress of Processing Mechanisms of Three Molecules of RNAi

XIAO Wen，ZHOU Wei* （College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128）

Abstract RNAi is a highly conserved gene silencing process mediated by small RNA.Based on the differences of small RNA length and its combined Agonaute （AGO） family members，small RNA is divided into 3 categories：miRNA （microRNA），siRNA （small interfering RNA） and piRNA （Piwi-interacting RNA）.Accordingly the reviews，we systematically expound the three small RNA genomic origin and the mechanisms of their production and processing.Furthermore，we summarize the connections among these three small RNAs.Finally，the authors offer a view on problems hindered in RNAi applications on disease treatment of the humans.The perfection of RNAi mechanisms is important to biological revolution，growth and development and treatment of critical illnesses like cancer.

Key words RNAi；miRNA；siRNA；piRNA

自1998年Fire和Mello首次提出RNAi（RNA interference，RNA干擾）概念以來[1]，越來越多的人開始重視小RNA的研究，之后RNAi在基因功能的研究中也得到廣泛應用。RNAi是一種存在于真核生物中的轉錄后基因沉默現象，在生物進化過程中能夠抵御病毒感染及防止基因組中由于逆轉座子元件擴增引起的不穩定。在miRNA （microRNA）、siRNA （small interfering RNA）及piRNA （Piwi-interacting RNA）等小RNA的介導下，RNAi能夠特異性地調控mRNA基因在表觀遺傳學水平、轉錄水平及轉錄后水平的表達。筆者闡述了miRNA、siRNA、piRNA這3類小RNA的基因組來源及其加工產生機制研究現狀，歸納和總結這3類小RNA之間的區別和聯系，以期深入了解小RNA在生物進化、生長發育以及各種疾病治療等方面的應用，進一步完善RNAi機制。

1 miRNA

1.1 miRNA簡介

miRNA是一類長度約為22 nt，在大多數體細胞中都廣泛存在的內源單鏈小RNA，由較長的含有莖環結構的前體加工而來。1993年Lee等[2]在秀麗隱桿線蟲中發現的lin-4，是第1個被人們所確認的miRNA。2000年Reinhart等[3]又在線蟲中發現了let-7，該miRNA在進化過程中非常保守，從而引起人們的重視，開啟了一個全新的miRNA時代。之后在植物、動物、單細胞真核生物、病毒等多類物種中陸續發現了miRNA[4-8]。目前在miRBase中收錄了223個物種的35 828個成熟miRNA，28 645個前體miRNA（version 21），其中人類成熟miRNA有2 588種，小鼠有1 982種。在miRNA介導的mRNA沉默過程中，miRNA與靶標mRNA堿基部分互補配對，而與之結合的Argonaute蛋白（AGO，AGO1～AGO4）通過招募脫腺苷酸化酶，導致靶標mRNA發生脫腺苷反應，進一步發生降解[9]，或者通過招募翻譯抑制因子，引起該mRNA翻譯抑制。miRNA與靶標mRNA的結合位點通常位于mRNA的3′UTR區[10]，但也有報道位于5′UTR區和編碼區的情況[11-12]。

1.2 miRNA加工機制

大部分miRNA是由RNA聚合酶II從基因組上轉錄形成含有莖環結構的初始轉錄本（pri-miRNA），該轉錄本帶有類似mRNA的5′端帽子和3′端polyA尾巴。細胞核內存在一種叫作“微處理器”的復合物（Microprocessor complex），包含核糖核酸酶III（RNaseIII）家族內切酶Drosha和輔助蛋白DGCR8（在哺乳動物中是DGCR8，在果蠅中是Pasha）。其中Drosha能夠識別pri-miRNA位于莖環基部的基序5′-UG-3′，DGCR8能夠識別pri-miRNA位于莖環頂部的基序5′-GUG-3′或5′-UGU-3′，因此“微處理器”能夠識別pri-miRNA并準確在距離基底結（basal junction）約11 bp處剪切，將pri-miRNA加工成長度約為70 bp的前體miRNA（pre-miRNA），此外，存在于莖的第7～9位堿基處的“錯配基序”-GHG（其中H指除了G之外的任意堿基）能夠加快pre-miRNA的加工過程。另外，在兩側對稱動物（bilaterian animals）中還發現一類位于基底結下游的基序CNNC，它能和輔助蛋白SRp20結合，同樣能夠有效地提高pri-miRNA的加工效率[13-16]。加工產生的pre-miRNA的3′端有2個堿基的懸垂，這種結構在Ran-GTP的介導下，被細胞核內的轉運蛋白Exportin-5識別，將其轉運到細胞質中。在細胞質中，pre-miRNA被另一種核酸內切酶Dicer及其輔助蛋白TRBP（The HIV transactivating response RNA-binding protein，在哺乳動物中是TRBP，在果蠅中是Loqs）切割并加工成大約22 bp的雙鏈miRNA[17]，通常雙鏈miRNA中5′末端堿基配對穩定性較差的那條鏈會被AGO蛋白結合，組裝形成miRNA介導的沉默復合體[18]（RNA-induced silencing complex，RISC）。在動物中，成熟miRNA主要通過種子區域（即從miRNA的5′端起2～7 nt堿基處）識別靶標mRNA，并通過其他位置部分互補配對方式招募下游因子TNRC6和CCR4-NOT復合物促使mRNA降解或招募翻譯抑制因子抑制mRNA的翻譯，調控靶標基因的表達[10-19]。

pri-miRNA還存在一些特殊的加工方式。2007年，David P.Bartel實驗室以及Eric C.Lai實驗室分別在果蠅中發現了miRNA成熟的另一種途徑[20-21]。他們發現有些內含子在被剪接復合體切下來后會具有pre-miRNA的結構特征，使其直接被Dicer加工成為雙鏈miRNA而不需要Drosha介導的切割，這類來源于內含子的miRNA被稱為“mirtron”。2010年，有3個實驗室分別在斑馬魚、小鼠以及人類細胞中發現miR-451這個高度保守的miRNA的發生不依賴于Dicer的切割，而是pri-miR-451在核內被Drosha/DGCR8復合物加工后產生pre-miR-451（其雙鏈區相對于普通的pre-miRNA要短，只有18 bp），后者出核后直接被AGO2蛋白在一個特異的位點切割并進一步被細胞內的PARN蛋白剪切[22]，生成大約23個核苷酸的成熟miR-451[23-25]。

此外，miRNA在動物體內廣泛存在成簇的現象，多個成熟的miRNA由同一個miRNA初始轉錄本加工合成，且這些來自相同基因簇的miRNA多具有較強的同源性[26]。另外，單一miRNA基因座可以通過miRNA加工成熟過程產生一系列亞型miRNA，稱為isomiR，它們在長度、在pre-miRNA上的5′端起始位置以及3′端終止位置存在差異[27]。生物體通過多樣化的加工方式，使得miRNA的產生形成一個復雜的調控網絡，以適應越來越復雜的生物多樣性及環境多樣性。

2 piRNA

2.1 piRNA簡介 piRNA是一類與Argonaute家族的PIWI亞家族蛋白特異結合的長度為25～32 nt的內源性小RNA，5′端多具有1 U偏好性，具有組織特異性，多存在于動物生殖細胞中，在成年期小鼠的大腦中也發現了piRNA[28]。果蠅PIWI家族成員有Piwi、AGO3、Aub；小鼠PIWI家族成員包括Miwi、Mili、Miwi2；而人類PIWI家族含有4個成員，分別命名為Hili、Hiwi、Hiwi2、Hiwi3。2001年Aravin等[29]在果蠅Y染色體上發現由Stallate同源的假基因Su（Ste）編碼的一類小RNA，就是現在的piRNA，能夠和PIWI家族的Aub相互作用。2006年Girard、Aravin、Grivna、Lau等所在的實驗室幾乎同時在人、小鼠、大鼠、果蠅等生物的生殖細胞中發現了piRNA[30-33]。迄今為止，piRNA種類是非編碼小RNA中最多的，piRBase中收錄的piRNA超過7 700萬種（version 1.0），其中黑腹果蠅達21 027 419種，并且它的piRNA超過80%來源于轉座子；小鼠piRNA達51 664 769種，主要是粗線期piRNA，這些piRNAs約93%來源于基因組單個位點[34]。piRNA在沉默轉座子、調控編碼基因、調節生育能力等方面發揮重要功能。

2.2 piRNA加工機制

piRNA序列主要來源于基因組上的基因編碼區、轉座子以及基因間隙等，且成簇分布，這些區域被稱為piRNA簇[35]。piRNA簇是由長的單鏈轉錄本加工而來，根據初始轉錄本方向又可分為單向piRNA簇和雙向piRNA簇。單向piRNA簇是具有單一方向轉錄本加工產生的簇；雙向piRNA簇是由兩端轉錄形成2條互補的轉錄本加工產生[35]。在果蠅卵泡細胞中（Follicular Cells），piRNA只有初級加工途徑，并在Yb小體中進行。Yb小體是胞漿中一種靠近細胞核的無膜細胞器，它包含Yb蛋白、Tudor結構域蛋白Vreteno （Vret）、SDE結構域蛋白Armitage （Armi）、FKBP家族蛋白shu等多種組分。這些初始轉錄產物被轉運到胞漿后，經Yb小體加工[36-39]，然后被線粒體外膜上的核酸外切酶Zuc及其輔助因子切割形成5′端成熟的piRNA前體[40-41]，該前體可與Piwi蛋白結合，再由Trimmer蛋白以及輔助因子papi去掉3′端多余的堿基形成成熟的piRNA，最后Hen1作用于piRNA 3′端，使其形成2-O-甲基化，形成成熟的初級piRNA[42-43]。

在生殖細胞中，piRNA的形成包括初級加工途徑和次級加工途徑。以果蠅為例，初級加工途徑與卵泡細胞中類似，首先轉錄產物轉運出核，由于生殖細胞沒有Yb小體和Yb蛋白，所以由1個與Yb小體類似的細胞器nuage代替，nuage存在2個Yb家族的蛋白，Brother of Yb （BoYb）和Sister of Yb （SoYb），取代Yb蛋白參與piRNA的初級加工[44]。初級piRNA的成熟可能有2種途徑：一種是在Spindle-E的協助下轉錄本結合Aub蛋白，再由Trimmer蛋白以及輔助因子papi剪切3′端多余的堿基形成成熟長度的piRNA，最后Hen1甲基化piRNA 3′端，形成成熟的初級piRNA；另一種是Aub蛋白結合轉錄本之后，Piwi蛋白結合在3′端，然后由Zuc剪切成兩段，兩者3′端分別被Hen1甲基化后形成2種初級piRNA：Aub-piRNA和Piwi-piRNA [43，45]。目前對生殖細胞中piRNA初級加工的具體途徑研究尚未明了。

結合Aub蛋白的初級piRNA進入次級加工途徑，Aub-piRNA通過堿基互補配對結合到反轉座子RNA上，靶標RNA被具有Slicer活性的Aub剪切，其3′端產物在Vasa的協助下與AGO3結合[46-47]，通過Zuc或者trimmer剪切，再由Hen1甲基化形成AGO3結合的成熟piRNA，AGO3-piRNA又識別、結合、剪切與之互補配對的piRNA簇，其3′端產物加工成新的Aub-piRNA，Aub-piRNA進入新一輪的循環產生新的AGO3-piRNA。此途徑既沉默了反轉座子，又形成了大量的次級piRNAs，這就是著名的“乒乓循環”模型（ping-pang model）。

“乒乓循環”模型產生的piRNA普遍有以下特點：Aub 主要與反義鏈piRNA結合，第1個堿基一般是 U，所以大部分piRNA的5′端有1U偏好性；而 AGO3 結合正義鏈piRNA，且與Aub結合的反義piRNA的5′端有10個堿基的互補配對，所以這部分piRNA第10個堿基有A偏好性[48]。

在哺乳動物中，piRNA的合成加工更加復雜。在小鼠精子發生過程中，piRNA主要分為3類：①主要來自基因組重復序列的出生前piRNA（prenatal piRNA），這部分piRNA能夠與Miwi2、Mili這2種蛋白結合，長度為26～28 nt。Mili蛋白出現在12.5 dpc（day post coitum），主要分布在細胞質中， Miwi2蛋白出現在14.5～15.5 dpc，主要分布在細胞核內。 Mili-piRNAs能自身發生“乒乓循環”，產生的piRNAs可以傳遞給Miwi2，Miwi2攜帶這部分piRNAs入核，招募DNMT3L進行甲基化從而在轉錄水平抑制轉座子；②來源于編碼基因的3′UTR區域的mRNA衍生piRNA（mRNA-derived piRNA），出生后的piRNA和大多數前粗線期piRNA是mRNA-derived piRNA，這類piRNA也是與Miwi2、MIli這2種蛋白結合，長度為26～28 nt，但其功能還是未知的；③來源于長非編碼轉錄本的粗線期piRNA，長度為29～31 nt，這部分piRNA的初始轉錄本在A-MYB的協助下從基因間隙轉錄，其加工過程也需要Tudor蛋白、Armi蛋白、核酸外切酶Zuc的參與。這類piRNA主要結合的Miwi蛋白出現在12.5 dpp （days post partum）之后。有報道稱Miwi-piRNA與脫腺苷酸酶CAF1形成的pi-RISC復合物通過與靶mRNA不完全互補配對，誘導靶mRNA脫腺苷酸而降解[49-50]。

3 siRNA

3.1 siRNA簡介

siRNA是一類經RNase III核酶家族的Dicer剪切后生成的長度約為21 bp的單鏈小RNA分子，特異性的與AGO蛋白家族中的AGO2結合，并利用AGO2的切割活性，介導靶標mRNA切割，并導致靶標mRNA的最終降解。Dicer加工過程中，形成19 bp堿基互補配對區，3′端有2個堿基懸垂的雙鏈siRNA前體。siRNA雙鏈中能夠與目標mRNA完全互補配對的那條鏈稱為向導鏈（guide stand），另一條則稱為passenger 鏈（passenger strand）。siRNA分子根據來源不同，分為外源性siRNA（exo-siRNA）和內源性siRNA（endo-siRNA）：體外人為導入形成的siRNA稱為外源性siRNA，細胞內轉錄加工產生的siRNA稱為內源性siRNA。1998年， Fire等[1]用秀麗隱桿線蟲進行反義RNA抑制試驗時發現，對照組中加入的雙鏈RNA（double-stand RNA，dsRNA）相比正義或反義RNA顯示更強的基因表達抑制，并首次將這種現象命名為RNA干擾。siRNA在作為小分子藥物治療疾病方面具有巨大的潛力。

3.2 siRNA加工機制

內源siRNA由雙鏈RNA（dsRNA）前體加工形成。在植物、真菌、線蟲及果蠅等低等動物體內存在一種特殊的RNA聚合酶RDRP（RNA-dependent RNA polymerase），在其作用下可將單鏈RNA轉變成dsRNA，然后被細胞內的Dicer識別并在協助蛋白TRBP的作用下切割加工產生雙鏈siRNA，但大部分動物體內沒有這種酶。后來發現動物雖然不能通過RDRP形成dsRNA，但可以通過反轉座子轉錄 、天然反義轉錄等方式產生形成dsRNA前體，從而產生內源siRNA[51]。

內源性siRNA主要來源于反轉座子。序列相同的2個轉座子基因沿相反方向轉錄產生的單鏈RNA可以形成互補的dsRNA，dsRNA出核后進入細胞質，再經Dicer酶剪切成siRNA[52-53]。研究發現，不同物種在siRNA加工產生的區域上區別很大，比如在果蠅體內，1個轉座子的整個轉錄產物都能形成siRNA[54]；而在日本血吸蟲體內，siRNA只來源于轉座子轉錄產物的部分區域[55]。因此，物種不同siRNA的產生機制可能也不完全相同。

另外某些基因在基因組上存在反義鏈轉錄本，當2條鏈同時被轉錄出來后[54]，正義鏈與反義鏈RNA形成dsRNA，該雙鏈RNA進入細胞質后經過Dicer酶剪切加工后可以形成siRNA。

外源siRNA有以下幾種來源：①由短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）加工形成，外源性shRNA一般采用H1、U6等啟動子，在細胞內RNA聚合酶III的作用下轉錄產生shRNA。shRNA有21～25 bp的堿基互補配對區域，在轉運蛋白Exportin-5和協助因子Ran-GTP的作用下轉運出核，在細胞質中被Dicer和協助蛋白TRBP識別并剪切，形成雙鏈siRNA[56-57]；②由shRNAmir加工形成，參照miRNA的加工途徑，把pri-miRNA中的miRNA序列改為siRNA序列，在RNA聚合酶II啟動子（CMN、EF1、CAG、TRE等 ）的作用下轉錄產生類似pri-miRNA結構的siRNA前體shRNAmir。這類前體可通過類似miRNA加工合成途徑，經Drosha及Dicer酶加工剪切后最終形成雙鏈RNA[58-59]；③體外直接合成，在體外可以人工直接合成siRNA，然后通過轉染的方法將21 bp的siRNA導入哺乳動物體細胞也能夠導致靶基因的沉默。這類siRNA，可通過堿基修飾的方法增加在細胞內的穩定性。

不管是外源導入還是細胞內加工形成的siRNA在細胞質內都與AGO家族的AGO2結合，其中siRNA的3′端結合AGO2蛋白的PAZ結構域，5′端結合AGO2蛋白的MID結構域[60]，形成RISC復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC復合體通過siRNA與靶標mRNA完全互補配對，在鎂離子和ATP的作用下，AGO2利用自身的核酸內切酶活性切割靶標RNA，產生的RNA片段受到5′或3′核酸外切酶的攻擊而迅速降解，從而達到轉錄后水平沉默靶基因的目的[61-62]。

4 3類小RNA之間的聯系與區別

雖然3類小RNA轉錄本長度都不超過40 nt，且都需要與AGO蛋白家族相互作用才能發揮功能，但三者之間還是存在一些區別：①在來源上，miRNA 是由不完全配對的發夾結構前體，經Drosha和Dicer酶加工而成；siRNA是由完全互補的長雙鏈RNA或發夾RNA，直接經Dicer酶剪切而成；piRNAs是由單條長鏈RNA前體加工形成，其過程不需要Drosha和Dicer酶的參與，其加工過程相比于前兩者更為復雜；②piRNA目前只在動物界發現，而siRNA、miRNA在動物和植物體內均存在；③在特征上，多數miRNA 具有很強的保守性、組織特異性和時序性；siRNA在序列識別方面具有高度特異性；piRNA的表達具有組織特異性，但其保守性較差，這一特性可能是為了更好地適應其抑制轉座子的功能；④在結合位點上，miRNA主要結合mRNA的3′UTR區；siRNA可結合在mRNA的任何部位，并且與mRNA完全互補配對；piRNA主要作用于轉座子序列；⑤在作用方式上，miRNA可以抑制mRNA的翻譯，也可以導致靶標RNA降解；siRNA主要導致靶標RNA的快速降解，也可以通過表觀遺傳水平，抑制靶標RNA的轉錄；而piRNA可在轉錄水平和轉錄后水平同時沉默轉座子等基因組自私性遺傳元件。

之前認為 miRNA、piRNA和siRNA三者作用途徑沒有聯系，并且它們之間存在明顯的區別。但近年來的研究表明，這些作用途徑之間有一部分存在交互影響 （reference），從而構成了一個高度復雜的RNA調控網絡，在表觀遺傳學水平、轉錄水平、轉錄后水平調控基因表達，保證有機體的正常生命活動。

5 問題及展望

曾經普遍認為基因組上的大量非編碼序列都是沒有任何功能的“垃圾序列”，在過去很長的一段時間內，這些序列始終沒有得到科學界足夠的重視，miRNA、siRNA以及piRNA等小RNA的發現，推翻了人們之前對非編碼區序列的認知，成為了RNA研究領域的一項重大突破。這一突破打開了小分子RNA的大門，小RNA調控生命活動成為一種新的重要調控機制，這也使得基因的表達調控網絡變得更加復雜，為復雜的生物進化提供了基礎。

目前隨著對小RNA研究的不斷深入，新的類型小RNA分子不斷出現在大家的視野中，已知的小RNA的功能與作用機制也在不斷地更新完善。與siRNA和piRNA相比，miRNA的發現相對較早，因此miRNA的作用機理也相對比較清楚，但仍有很多miRNA的功能是不清楚的。隨著對miRNA作用機制研究的不斷深入，結合現有的高通量測序技術等手段，人們對生物基因表達調控網絡的認識也在不斷加深，這也為疾病的診斷、預后與治療提供理論依據和應用基礎；對于siRNA，隨著對RNA干擾技術的深入了解，siRNA的作用機制被不斷完善，其作為基因靶向沉默治療的潛力也在被不斷挖掘，但就目前來看，依舊存在一些問題，例如由于miRNA和siRNA在加工成熟時都要用到細胞內源的Drosha、Dicer和Exportin-5等蛋白因子，細胞內過表達siRNA時就會對miRNA的表達造成競爭壓力，因此如何協調兩者之間的關系成為RNA載體設計的挑戰之一。其次，由于RNAi存在脫靶現象，可能會對細胞內很多非靶向基因的表達造成影響，雖然已經存在一些技術能夠減少脫靶所帶來的副作用，但如何更大程度甚至完全消除毒副作用，還有待于進一步研究。另外piRNA的發現無疑是為小RNA的研究開辟了一片新領域。迄今為止，盡管關于piRNA的研究已經取得了相當大的進展，但由于piRNA發現較晚，其生物合成途徑及調控機制仍然有待于進一步完善，比如初級加工途徑與次級加工途徑中的具體加工細節，piRNA如何調控基因表達等。

小RNA的發現與功能補充和完善了中心法則，促使科研人員重新思考細胞的調控與發育問題。隨著對這些小RNA認識不斷深入，RNA干擾技術也越來越完善，為新型RNAi治療提供新的理論基礎，對于小RNA在生命起源與進化、生長發育、疾病治療等方面也將有更加深入的了解與把握。總而言之，在之后的研究當中通過結合小RNA的加工機制改造RNAi載體等RNA分子機器以提高效率，減少或消除對機體的副作用，從而能夠將RNAi技術運用到更廣泛的領域當中。

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