青花菜綠雄60小孢子單核靠邊期與花蕾外部形態特征研究

朱惠霞　陶興林　胡立敏　劉明霞

摘要：以青花菜F1代雜交種綠雄60為材料，研究了青花菜小孢子單核靠邊期花蕾的特征。結果表明，通過整枝可以得到發育整齊的青花菜小孢子花蕾，當花蕾長度為3.70～4.70 mm時，單核靠邊期小孢子比例最高，此時花蕾為綠色，花藥黃綠色，花瓣/花藥為0.83～1.00。以上指標可以作為青花菜小孢子取樣的參考指標。

關鍵詞：青花菜；綠雄60；花蕾長度；小孢子；單核靠邊期

中圖分類號：S635.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2017）06-0019-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.06.007

Studies on the Characteristic of Mid-late Uninucleate Stage of Lüxiong 60

Brassica oleracea L .

ZHU Huixia， TAO Xinglin， HU Limin， LIU Mingxia

（Institute of Vegetables， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：Lüxiong 60 of Brassica oleracea L as the experimental material， the characteristics of mid-late uninucleate stage of microspore bud side is researched. The result shows that the training can get a neat microspore bud development， when the bud length is 3.70 ～ 4.70 mm， mononuclear side has the highest percentage of microspore stage， the buds of green， anthers yellow-green， petals/anther ratio is 0.83 ～ 1.00. These indicators can be a reference index of broccoli microspore sampling， provide the basis for accurate sampling.

Key words：Brassica oleracea L.； Lüxiong 60；Flower buds； Microspore； Mid-late uninucleate stage

近30年來，我國許多單位開展了青花菜小孢子培養技術研究，對影響小孢子出胚的主要因素如材料的基因型、花蕾取樣時期、培養基成份、預處理方式等方面進行了大量研究[1 - 4 ]，建立了小孢子培養技術體系。大量研究認為，適合青花菜小孢子培養的適合時期是單核靠邊期，且單核靠邊期小孢子占70%以上時，才有可能獲得成 功[5 - 6 ]。但不同基因型的供體植株間小孢子培養最佳時期也不同，且在大批量的小孢子培養過程中，通過鏡檢進行取樣則費時費力，因此，在培養前對花蕾的形態指標與小孢子發育時期的對應關系進行研究顯得尤為重要。我們以青花菜綠雄60為研究材料，在花球膨大過程中進行了2～3次整枝，以期得到發育同步性一致的花蕾，并觀察花粉的發育時期，研究花蕾外部形態與小孢子發育時期的對應關系，確定小孢子單核靠邊期花蕾縱橫徑、花瓣長、花藥長、花瓣/花藥（P/I）比值、花藥顏色、花瓣顏色等一系列特征，以期為青花菜小孢子培養精準選樣提供參考依據，旨在為青花菜小孢子培養技術體系進入規模化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為青花菜F1代雜交種綠雄60。于2016年8月25日育苗，9月20日定植至日光溫室，正常田間管理，培養植株抽薹開花，11月底初花期開始采集花蕾供試。

1.2 整枝方法

花球直徑8～10 cm時第1次削球疏枝，花徑伸長后進行2～3次整枝疏花[7 ]，每株保留3～4個主枝，每個主枝留3～4個1級分枝，最終只20個左右花序用于試驗，以自然抽薹不整枝植株上的花蕾為對照。

1.3 取樣及觀測方法

晴天8：00～9：00時采摘青花菜花序，用游標卡尺測量花蕾長度，按長度分為5個等級：2.00～2.99、3.00～3.99、4.00～4.49、4.50～4.99、5.00～6.00 mm，每個等級取5個花蕾，計算平均值。先在載玻片上滴一滴醋酸洋紅染液，然后用鑷子將花藥從花蕾中剝出，置于載玻片上，輕輕擠壓，使花藥中的小孢子均勻游離于染液中。去除花藥壁等雜質，蓋上玻片，制成臨時壓片，顯微鏡下觀察小孢子的細胞學特征，隨機觀察5個視野，統計單核靠邊期小孢子所占比例，比較整枝處理對小孢子發育同步性的影響，確定單核靠邊期至雙核早期所對應的花蕾長度及其他特征。

2 結果與分析

2.1 整枝對花蕾發育同步性的影響

從結球期到開花期，經過整枝處理的植株花序營養充足，長勢強，發育快，開花期提早3～5 d，花蕾飽滿（圖1A、B）。顯微觀察發現，不同長度的花蕾小孢子發育時期整齊一致（圖1C），同一時期的小孢子能達到60%以上，適宜進行小孢子培養。未經整枝的花球由于營養不足，花球抽薹較慢，且干花較多，花蕾瘦小（圖1C、D），由于花球內部通透性差，花球中間有腐爛，顯微觀察發現，花蕾小孢子發育極不同步（圖1F），即在同一花蕾中存在各個發育時期的小孢子，單核靠邊期的小孢子在50%以下，不適宜進行小孢子培養。

2.2 小孢子不同發育時期的形態觀察

對青花菜綠雄60不同大小花蕾小孢子進行顯微觀察發現（圖2），花蕾長2.00 mm以下時，花蕾中的花粉細胞大多處于四分體時期，隨著花蕾的長大，四分體逐漸釋放形成單個小孢子。早期的小孢子，體積較小，花粉壁較薄，細胞核位于中央，形狀似小梅花（圖2A），三棱狀明顯；隨后小孢子體積逐漸增大，內含物增多，液泡增大，顏色逐漸加深，外形逐漸接近圓形，細胞核位于花粉邊緣（圖2B），此時為單核靠邊期，小孢子繼續發育膨大，形成1大1小2個核，較大的營養核染色較淺，較小的生殖核染色較深，此時為雙核早期（圖2C）。若在青花菜生長過程中不進行疏枝，則花蕾發育會出現不同步性，嚴重影響小孢子的培養效果。

2.3 不同長度花蕾中單核靠邊期小孢子所占比例

以整枝處理過的植株上不同長度的花蕾為材料，每組選5個花蕾，用游標卡尺測量長度，顯微鏡下每花蕾取5個視野觀察，統計單核靠邊期小孢子所占比例，計算平均值。花蕾長度為2.40～3.20 mm時，小孢子基本處于單核早期；花蕾長度為3.21～3.69 mm時（表1），大多數小孢子處于單核中期；花蕾長度3.70～4.70 mm時，單核靠邊期所占比例較大，其中花蕾長度4.20 mm時達72%，此時適合進行小孢子培養。而花蕾長度超過4.70 mm時，個別花粉粒逐漸趨于橢圓形，隨著長度增大，單核靠邊期小孢子所占比例逐漸減少，花粉粒變為橢圓形，接近成熟。因此，取樣時候可以在4.20 mm左右范圍重點觀察，力爭精確取樣。

2.4 花瓣與花藥比值（P/I）與小孢子單核靠邊期的關系

以整枝處理過的植株上的花蕾為材料，重點測定花蕾長度在3.20～5.40 mm的花蕾長度。用鑷子輕輕撥開花蕾，取下花瓣和花藥，分別用游標卡尺測定長度，每組花蕾測定5個花蕾，計算平均值，再顯微觀察對應的花藥小孢子發育時期。發現P/I值在0.93時，單核靠邊期小孢子所占比例最大，為72%，最適合進行小孢子培養；大于或小于0.93時，所占比例逐漸下降，在P/I為0.83和1.00時分別為66%和57%，可以進行培養。因此，在具體進行小孢子培養的試驗中，合適的P/I值為0.83～1.00，在此范圍內可進一步精確。P/I值受基因型影響較小，與材料花蕾本身的大小無相關系，可以作為取樣的可靠標準。

2.5 不同長度花蕾發育形態特征

從表1可以看出，在花蕾的整個發育過程中，花蕾顏色變化順序為淡黃→黃綠→綠→深綠，花藥顏色變化順序為綠→淡綠→黃綠→黃色，花蕾顏色逐漸變深，直至成熟開放。觀察不同花蕾長度下相應的花藥，發現處于單核靠邊期的花蕾顏色為綠色，而花藥顏色是淡綠或者黃綠色，在取樣時，首先可將花蕾和花藥顏色作為參考標準進行粗取樣，然后再通過其余指標綜合判斷，達到精確取樣的目的。

3 結論

青花菜綠雄60花球經過2～3次疏枝和后期疏蕾后，小孢子發育整齊一致，適合進行小孢子培養研究。花蕾長度在3.70～4.70 mm時，單核靠邊期所占比例較大，此時花蕾橫徑2.33～2.75 mm，縱/橫比值1.58～1.71，花瓣長度2.00～3.40 mm，花藥長度2.40～3.40 mm，花瓣/花藥比值0.83～1.00，花蕾綠色，花藥淡綠到黃綠色。在實際操作中因材料基因型和栽培管理方式不同，花蕾大小不同，花蕾縱橫徑也不同，因此不能依據單一標準進行取樣。但花瓣/花藥比值和花藥顏色可以做為取樣參考標準，結合多個指標，在一定范圍內取樣觀察，將大大減少工作量，提高取樣的精確性。

參考文獻：

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（本文責編：鄭立龍）