梨樹揮發物成分的鑒定及其對梨葉斑蛾的觸角電位反應

張曉芳 劉紅敏 張愛紅 方川 張濤

摘要[目的]篩選梨葉斑蛾引誘物質。[方法]利用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）分析了梨樹揮發物的主成分，并通過觸角電位儀（EAG）測定了梨葉斑蛾對主要揮發物的電生理反應。[結果]梨葉中共鑒定出包含萜類、酯類、醛類及醇類在內的24種主要揮發物。梨葉斑蛾雌雄蛾對供試揮發物均可產生EAG反應，其中雌蛾對芳樟醇、月桂烯、反-β-羅勒烯的反應最明顯；雄蛾對芳樟醇、反-β-羅勒烯、α-法尼烯的反應最強烈。劑量反應試驗結果表明，梨葉斑蛾雌蛾對3種供試化合物的EAG活性與化合物的劑量之間呈正相關性。[結論]試驗結果為制定基于植物源的梨葉斑蛾監測與防治策略提供了理論依據。

關鍵詞梨葉斑蛾；梨葉揮發物；觸角電位；氣相色譜-質譜聯用

中圖分類號S436.612.2+3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0145-04

Pear Leaf Volatiles and Their Electroantennogram Responses to Illiberis pruni

ZHANG Xiaofang1， LIU Hongmin2， ZHANG Aihong1， ZHANG Tao1* et al

（1. Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences， IPM Center of Hebei Province， Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China， Ministry of Agriculture， P. R. China， Baoding， Hebei 071000；2. Xinyang College of Agriculture and Forestry， Xinyang， Hebei 464000）

Abstract[Objective] The aim was to screen attractants of I. pruni.[Method] The main volatiles， identified from pear leaf by using gas chromatographymass spectrometry （GCMS） were tested by electroantennogram （EAG）.[Result] The 24 compounds were identified， including terpenoids， esters， aldehydes and alcohols. EAG tests showed that male and female moths had EAG response to all tested compounds， and the responses of male moths to linalool， myrcene and （E）βOcimene were the most significant， meanwhile， for female moths， linalool， （E）βOcimene and αfarnesene were the most EAGactive compounds. Further doseresponse experiments showed that the responses of female moths to the three compounds were obviously dosedependent.[Conclusion] The results provide the basis for developing plant volatilesbased strategy for monitoring and controlling of I. pruni.

Key wordsIlliberis pruni；Pear leaf volatile；Electroantennogram （EAG）；Gas chromatographymass spectrometry （GCMS）

作者簡介張曉芳（1984—），女，山東聊城人，助理研究員，碩士，從事昆蟲化學生態學研究。

*通訊作者，助理研究員，博士，從事昆蟲化學生態學研究。

收稿日期2017-01-22

梨葉斑蛾（Illiberis pruni），幼蟲別名梨星毛蟲，又名梨狗子、餃子蟲等，是鱗翅目斑蛾科翅葉斑蛾屬的一種昆蟲，廣泛分布于河北、河南、山西、安徽等省，是梨、蘋果、海棠、杏、櫻桃等仁果類果樹的主要食葉性害蟲之一。梨葉斑蛾的幼蟲主要取食花芽和葉片，對果樹的品質和產量造成了很大影響[1]，在管理粗放的果園危害尤為嚴重。梨葉斑蛾的幼蟲有吐絲卷葉、潛伏葉苞為害的習性，因而影響了化學防治的效果[2]。而且，化學防治存在農藥殘留污染及容易產生抗藥性等問題，因此，環境友好型措施防治該蟲十分必要和迫切。

通常認為，植食性昆蟲依靠寄主植物的特定揮發物來定位寄主，以獲取適宜的取食、產卵、交配場所[3]。通過植物揮發物調節昆蟲的行為是目前許多研究者正在探索的環境友好的害蟲防治方法之一[4]。該方法通常是先鑒定害蟲定位寄主的關鍵揮發物，進而將其用作引誘劑誘殺害蟲，從而壓低害蟲密度達到防控的目的。而昆蟲觸角電位技術（Electroantennogram，EAG）能夠從電生理角度反映出昆蟲對揮發性氣味物質的響應情況，從而甄別昆蟲對哪些物質更感興趣，快速完成害蟲引誘物質的初步篩選[5-7]。

目前，國內關于梨葉斑蛾的引誘或趨避技術的研究鮮見報道。筆者以動態頂空吸附法收集梨葉揮發性氣味物質，并使用氣相色譜-質譜聯用技術鑒定其主要組分，同時結合觸角電位技術，測定了梨葉斑蛾的觸角對供試化合物的電位響應及其濃度效應，初步明確了它們的相對活性，旨在為闡明梨葉斑蛾寄主選擇機理以及篩選出對梨葉斑蛾具有生物活性的植物源引誘劑或趨避劑提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試昆蟲。梨葉斑蛾的蛹于河北保定清苑區溫仁鎮廢棄果園采集獲得，帶回實驗室后置于養蟲籠內，每天觀察蛹的羽化情況；羽化后按觸角形狀將雌、雄蛾分開，以體積濃度為5%的蜂蜜水飼養；并選擇羽化后2～3日齡的健康成蟲為供試昆蟲。

1.1.2供試化合物。供試化合物的名稱、純度、來源見表1。

1.1.3

試劑與儀器。Porapak Q（80～100目），購自美國Waters公司。7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，為美國安捷倫公司產品；HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱，為美國安捷倫公司產品；觸角電位儀和分析軟件為荷蘭Syntech公司產品。

1.2方法

1.2.1梨樹揮發物的收集。試驗用梨樹葉采自河北保定清苑區南劉口村梨園，試驗品種為黃冠。采用QC-1B型氣體采樣儀（北京市勞動保護科學研究所）和采樣管（Φ 0.6 cm×16.0 cm）對梨樹的揮發物進行動態頂空收集。每根采樣管填充50 mg吸附劑Porapak Q。具體操作：采集新鮮完整的梨樹葉50 g，用清水沖洗干凈，擦干表面水分晾干后放入孟氏洗瓶中。洗瓶一端連接裝有吸附劑的采樣管，一端連接裝有活性炭吸附劑的玻璃管。采樣管的另一端連接氣體采樣儀的進氣口。所有連接處均用特氟龍管連接。采樣氣流為300 mL/min，采集時間為6 h。采集后的采樣管用10 mL色譜純正己烷洗脫至1.5 mL進樣小瓶內，置于-24 ℃冰箱內待用。

1.2.2

梨樹揮發物的測定。采用7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀對“1.2.1”所得樣品進行測定。色譜分析條件：HP-5MS毛細管柱，柱溫箱初始40 ℃，保持1 min；以5 ℃/min升至180 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。氦氣（純度>99.999%）做載氣，流速1 mL/min。進樣口溫度250 ℃，不分流進樣。

質譜分析條件：電離方式EI，質譜轟擊電離能量70 eV，掃描質量50～400 m/z，四級桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃。

經NIST14譜庫檢索，并結合標準品質譜圖及保留時間對揮發物樣品進行定性分析，相對含量采用峰面積法。

1.2.3

觸角電位試驗。采用觸角電位儀和分析軟件進行試驗。參照Yang等[8]的方法進行EAG反應測定。測定前將較活躍的梨葉斑蛾雌雄蛾的整根觸角自基部切下，切掉末梢，用昆蟲針將觸角兩端連接在涂有導電膠的電極上，待基線穩定后進行電生理活性試驗。

取24 μL待測樣品溶液，均勻涂在濾紙條（2.0 cm×0.5 cm）上，待溶劑揮發后放入巴斯德管中，然后將巴斯德管連接在刺激氣流上。調節連續氣流流量為500 mL/min，刺激氣流為40 mL/min，每次刺激時間為0.1 s，2次刺激間隔為30 s，以恢復觸角的敏感性。每個樣品雌、雄蛾各測試5個觸角。以順-3-己烯醇的反應值為參照，以正己烷為對照，測試樣品前后均測試1次對照。

1.3數據處理

試驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，并利用Duncan′s多重分析法比較梨葉斑蛾對供試化合物的觸角電位反應差異。

梨葉斑蛾對化合物的觸角電位響應用EAG反應相對值表示[9]。EAG反應相對值由以下公式算出：

Sr=Sc-CKmRm-CKm×100

式中，Sr為刺激樣品的EAG反應相對值；Sc為刺激樣品的EAG反應值；CKm為正己烷的EAG反應值；Rm為參照化合物順-3-己烯醇的EAG反應值。

2結果與分析

2.1梨樹揮發物組分的鑒定

動態頂空收集的黃冠梨樹葉揮發物樣品經GC-MS分析，共檢測出28種主要組分，經NIST14譜庫檢索并比對標準品保留時間鑒定出了其中24種化合物成分（圖1、表2）。鑒定出的24種化合物均在其他植

物葉片中有所報道，為常見的綠葉揮發物質。梨樹葉揮發物的種類主要包括萜類、酯類、醛類以及醇類，且以萜類化合物的相對含量最高，所占比例大于80%，顯著高于其他類化合物。從單一物質含量來看，含量最高的3種化合物依次為反-β-羅勒烯、反-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯和α-法尼烯。

2.2梨葉斑蛾雌雄蛾對24種供試化合物的EAG反應

根據表2的結果，進行了梨葉斑蛾雌、雄蛾對鑒定出的24種化合物的EAG反應，結果見表3。所有供試化合物的濃度均為100.0 mg/L。表中EAG反應相對值小于100%表示該揮發物的EAG響應值低于參照化合物順-3-己烯醇的EAG響應值。供試的24種化合物均能引起梨葉斑蛾的EAG反應，但反應強弱各異。從化合物的類型看，無環單萜類、倍半萜類、脂肪酸衍生物以及芳香族化合物的EAG反應較強，而單、雙環單萜類化合物的EAG反應較弱。具體到化合物而言，引起梨葉斑蛾雌蛾較大EAG反應的是芳樟醇、月桂烯和反-β-羅勒烯，較小EAG反應的化合物為莰烯、茴香烯和香樹烯；其他化合物居中；而引起梨葉斑蛾雄蛾較大EAG反應的是芳樟醇、羅勒烯及α-法尼烯，較小EAG反應的化合物為莰烯、茴香烯及檸檬烯。

將雌雄梨葉斑蛾對24種供試化合物的EAG反應進行比較，發現雌雄蛾的反應趨勢基本一致，說明雌雄蛾可能都利用梨葉揮發物定位寄主。

2.3梨葉斑蛾雌蛾對3種揮發物不同劑量的EAG反應

根據表3的結果，梨葉斑蛾雌蛾對芳樟醇、月桂烯和反-β-羅勒烯的EAG反應最強，所以測定了雌蛾對這3種物質不同劑量的EAG反應。由圖2可知，梨葉斑蛾雌蛾對3種揮發物的EAG響應存在明顯的濃度效應，總的趨勢是EAG隨著濃度的增大而增大，但是3種被測揮發物的響應趨勢不盡相同。其中，在所測定的濃度范圍內，梨葉斑蛾雌蛾對月桂烯的EAG反應值從0.1 mg/L到1 000.0 mg/L呈顯著正相關；對芳樟醇的EAG反應值是先降低后上升，且到達一定的濃度（100.0 mg/L）后，EAG值增加平緩，說明該濃度可能已經超出雌蛾的感受閾值；對反-β-羅勒烯的EAG反應值是先升高后降低，最大值出現在100.0 mg/L處。

3結論與討論

自然界中植食性昆蟲和寄主植物之間存在協同進化關系，寄主植物為昆蟲提供棲息場所和食物來源[10]。化學信號物質在昆蟲和寄主植物之間起著重要作用，大量研究表明植物揮發物是昆蟲定位寄主的關鍵因素[11]。

自然狀態下，梨葉斑蛾經過選擇寄主、聚集并最終定殖，完成其生活史。不同種的昆蟲具有不同的寄主搜索行為，目前尚未明確梨葉斑蛾的定位機制。筆者在保定果園調查發現，梨葉斑蛾幼蟲在梨樹上大量發生，而不為害緊鄰梨樹的櫻花等綠化樹木。據此推斷，梨樹葉片揮發物中可能含有梨葉斑蛾用來尋找并定位寄主的關鍵物質。該研究發現，梨葉斑蛾對包括芳樟醇、月桂烯、羅勒烯、反-2-己烯醛等在內的多種被測化合物有較強的觸角電位反應。有文獻報道，上述化合物可引起華北大黑鰓金龜、綠盲蝽、橘小實蠅以及油橄欖果實蠅等昆蟲產生較強的EAG反應[12-15]。與其他昆蟲類似，梨葉斑蛾對寄主揮發物的EAG反應具有明顯的劑量效應，當刺激物達到一定濃度后，EAG值趨于恒定或降低，說明該測試濃度達到其反應閾值。Contreras等[16]認為觸角電位反應指示該刺激物對測試昆蟲有引誘或趨避作用，該研究結果可為篩選對梨葉斑蛾具有引誘或趨避作用的活性物質提供依據。

有學者指出，寄主揮發物的混合組分對昆蟲的引誘效果比單組分揮發物對昆蟲的引誘效果更顯著[17]。該研究測定了梨葉斑蛾對梨樹揮發物單組分的觸角電位效應，但各單組

分混合后對昆蟲的作用效果可能不同，這種有效混合組分的

配比及其作用機制等尚需進一步研究。

參考文獻

[1] 張洪喜，張江民.梨葉斑蛾（梨星毛蟲）生活習性及防治[J].河北果樹，1990（2）：17-19.

[2] 李冬梅，李連昌，任自立，等.梨星毛蟲性信息素的研究I：求偶與交配行為的觀察[J].山西農業科學，1996，24（3）：47-50.

[3] 杜家緯.植物-昆蟲間的化學通訊及其行為控制[J].植物生理學報，2001，27（3）：193-200.

[4] 蔡曉明，孫曉玲，董文霞，等.蟲害誘導植物揮發物（HIPVs）：從誘導到生態功能[J].生態學報，2008，28（8）：3969-3980.

[5] NGUMBI E，CHEN L，FADAMIRO H Y.Comparative GCEAD Responses of a specialist（Microplitis croceipes）and a generalist（Cotesia marginiventris）parasitoid to cotton volatiles induced by two caterpillar species[J].Journal of chemical ecology，2009，35（9）：1009-1020.

[6] 鄧思思，尹姣，曹雅忠，等.華北大黑鰓金龜對20種植物源揮發物的電生理和行為反應[J].植物保護，2011，37（5）：62-66.

[7] BHOWMIK B，LAKARE S，SEN A，et al.Olfactory stimulation of Apis cerana indica towards different doses of volatile constituents：SEM and EAG approaches[J].Journal of AsiaPacific entomology，2016，19（3）：847-859.

[8] YANG M W，DONG S L，CHEN L.Electrophysiological and behavioral responses of female beet armyworm Spodoptera exigua（Hübner）to the conspecific female sex pheromone[J].Journal of insect behavior，2009，22（2）：153-164.

[9] 王明，伍德明，閻云花，等.新疆棉鈴蟲性信息素的電生理研究[J].華中農業大學學報，1999，18（4）：311-316.

[10] 李典謨，周立陽.協同進化：昆蟲與植物的關系[J].昆蟲知識，1997，34（1）：45-49.

[11] BRUCE T J A，WADHAMS L J，WOODCOCK C M.Insect host location：A volatile situation[J].Trends in plant science，2005，10（6）：269-274.

[12] 隋學良，許志春，田呈明.杏樹揮發物成分的鑒定及其對杏樹皺小蠹的觸角電位的測定[J].應用昆蟲學報，2012，49（4）：980-985.

[13] 張國娜，王進軍.桔小實蠅對幾種寄主揮發物的觸角電位反應[J].環境昆蟲學報，2016，38（1）：126-131.

[14] 張俊宇，林克劍，黃欣蒸，等.綠盲蝽對七種錦葵科植物揮發物的EAG和趨向行為反應[J].中國生物防治學報，2016，32（2）：135-141.

[15] MALHEIRO R，ORTIZ A，CASAL S，et al.Electrophysiological response of Bactrocera oleae（Rossi）（Diptera：Tephritidae）adults to olive leaves essential oils from different cultivars and olive tree volatiles[J].Industrial crops and prodults，2015，77 ：81-88.

[16] CONTRERAS M L，PEREZ D，ROZAS R.Empirical correlations between electroantennograms and bioassays for Periplaneta americana[J].Journal of chemical ecology，1989，15（11）：2539-2548.

[17] WEBSTER B，BRUCE T，PICKETT J，et al.Volatiles functioning as host cues in a blend become nonhost cues when presented alone to the black bean aphid[J].Animal behaviour，2010，79（2）：451-457.