1型糖尿病大鼠左心室HCN4表達實驗研究

摘 要： 目的探討4型超極化激活環核苷酸門控陽離子通道在1型糖尿病大鼠左心室的表達.方法腹腔注射鏈脲佐菌素溶液建立1型糖尿病大鼠模型，通過免疫熒光染色和免疫印記觀察HCN4在左心室的表達.結果免疫熒光染色HCN4在大鼠左心室未見表達，免疫印記顯示糖尿病大鼠左心室HCN4在蛋白質水平升高（P<0.05）.結論正常大鼠左心室表達HCN4，T1DM左心室HCN4表達升高，導致糖尿病心室電重構可能與室性心律失常發生有關。

關鍵詞：1 型糖尿病 HCN4 左心室

中圖分類號：R587 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2016）12-0257-01

心臟起搏細胞反復除極的離子基礎是超級化電流（If），If作為心肌舒張期去極化的主要決定因素在細胞自律性的產生過程中起著重要作用.其形成的分子基礎是編碼超極化激活的環化核苷酸門控通道（HCN）基因家族，該家族包括HCN1-4四種亞型，心室肌主要表達HCN2，少量表達HCN4.HCN4是控制心率的主要因素.1型糖尿病引發的糖尿病心肌病其發病機制不明，本實驗通過T1DM模型觀察左心室HCN4在蛋白質水平變化，為探討1型糖尿病的常見并發癥如室性心律失常的發生提供更多理論依據。

一、材料與方法

1.材料 成年健康雄性SD大鼠60只體重（170±20）g.兔多克隆抗HCN4抗體（Alomone公司）、TR標記山羊抗兔IgG二抗（Santa cruz 公司）、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP二抗（北京博奧森生物技術有限公司）

2.方法 1.2.1模型制作：動物隨機分兩組即對照組（20只）和實驗組（40只）.兩組大鼠普通飲食喂養1w后禁食12h，對照組大鼠腹腔一次性注射不含STZ的檸檬鈉-檸檬酸緩沖液，實驗組大鼠55mg/kg一次性腹腔注射STZ，3d后取尾靜脈血測空腹血糖，血糖≥16.7mmol/L者為糖尿病大鼠.模型成功后均持續喂養3m。1.2.2取材：麻醉后取左心室，部分（對照組10只實驗組14只）液氮速凍用作冰凍切片；一部分（對照組10只實驗組15只）液氮速凍用于免疫印跡實驗。1.2.3免疫熒光染色：LeicaCM1850恒冷冰凍切片機中進行切片厚度10um.一抗HCN4抗體（1：50），二抗TR標記山羊抗兔IgG（1：300），熒光顯微鏡下觀察熒光的分布。1.2.4免疫印跡反應（Western Blot）：兩組左心室組織提取蛋白質進行WB分析.兔抗大鼠HCN4（1：400）、兔抗大鼠β-Actin抗體（1：500）作為一抗，辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗（1：2000），ECL顯色.用凝膠成像分析儀采集圖像及ImageJ圖像處理軟件進行吸光度分析

3.統計學分析 SPSS14軟件進行分析，組間比較采用t檢驗

二、結果

1.免疫熒光染色：左心室縱切面上兩組都未見HCN4的表達。2.2Western Blot：12w時，對照組檢測到HCN4蛋白質弱表達，糖尿病組檢測到HCN4蛋白質表達明顯升高，與對照組相比有顯著性差異（P<0.05） （表1、圖1和2）

A、B分別代表實驗（DM）組和對照組

三、討論

HCN4是正常起搏電流產生的重要因素對基礎心率的維持起重要作用并能隨著機體的不同生理狀態對頻率進行調整.研究證實HCN4通道的異常與某些心臟疾病有關[1]。在心衰或者心肌肥大的病人心室肌HCN4在mRNA和蛋白質水平都增加，室性心律失常時HCN4表達亦上調[2]，我們推斷這可能是由If過度表達引起.在老年自發性高血壓大鼠模型中發現If表達增多，心室起搏電流是正常鼠的5倍同時HCN4的表達上調，用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療會顯著地降低If電流的最大電導，通過抑制If電流，可以減慢心.本實驗中通過免疫熒光在心室肌上未見HCN4，Western blot顯示正常左心室HCN4 少量表達，1型糖尿病大鼠左心室HCN4表達明顯增高，與上述文獻報道的其他心臟疾病電重構的變化一致[3]?？梢姴±砬闆r下HCN4通道在普通工作心肌中表達升高使其具有產生起搏電流的特性，這可能與心律失常發生有關.深入研究病理情況下HCN4的變化對各種心律失常疾病有一定的預防和治療作用.

參考文獻

[1]Lin H，Xiao J，et al.Transcriptional control of pacemaker channel genes HCN2 and HCN4 by Sp1 and implications in reexpression of these genes in hypertrophied myocytes[J].CellPhysiol Biochemm，2009， 23（4-6）：317-26

[2]Wu X，Jiang X，et al.Expression of HCN4 protein in ventricular outflow tract of rabbit with idiopathic ventricular tachycardia[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2015，95（44）：3620-4

[3]王慶志，周立等.1型糖尿病大鼠左心室 HCN2和 HCN4重構[J].中國臨床解剖學雜志，2011，29（3）：321-324

作者簡介：張麗（1981-）女，湖北潛江市，碩士，助教，心臟基礎研究。