白芍總苷對糖尿病腎病大鼠的治療作用及對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響

宋菲，楊發奮

(右江民族醫學院附屬醫院，廣西百色533000)

白芍總苷對糖尿病腎病大鼠的治療作用及對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響

宋菲，楊發奮

(右江民族醫學院附屬醫院，廣西百色533000)

目的 觀察白芍總苷(TGP)對糖尿病腎病(DN)大鼠的治療作用，及其對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響，探討其腎臟保護機制。方法 采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立DN模型，隨機分成正常對照組、DN組及TGP低、中、高劑量組。正常對照組、DN組每天給予生理鹽水灌胃，TGP低、中、高劑量組分別給予50、100、200 mg/(kg·d)TGP灌胃。實驗8周末觀察各組體質量、血糖、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24 h尿蛋白定量，并行免疫組化法檢測腎組織中轉化生長因子β1(TGF-β1)與結締組織生長因子(CTGF)的表達。結論 與正常對照組相比，DN組血糖升高、體質量下降、BUN和24 h尿蛋白定量明顯升高(P均<0.01)。與DN組相比，TGP各劑量組大鼠BUN水平均降低，TGP高劑量組24 h尿蛋白定量減少(P均<0.01)；TGP中、高劑量組腎組織CTGF、TGF-β1表達均降低(P<0.05或<0.01)。結論 TGP灌胃對DN大鼠具有治療作用，可改善腎功能，下調TGF-β1、CTGF在腎組織中的表達，從而發揮保護腎臟、延緩DN進展的作用。

白芍總苷；糖尿病腎病；大鼠；轉化生長因子；結締組織生長因子；大鼠

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)并發微血管改變的最常見并發癥之一，是引起終末期腎病的主要原因，同時也是DM患者的主要死亡原因之一。DN進展可能與持續性的低濃度炎癥反應和細胞外基質(ECM)不斷累積有關[1]，轉化生長因子β1(TGF-β1)與結締組織生長因子(CTGF)在DN的發生發展中起重要作用。TGF-β1可刺激成纖維細胞生成ECM、降低多種ECM降解酶的活性、誘導腎小管上皮細胞-間充質細胞轉化，促使腎小球硬化的發生[2]；激活腎小管上皮細胞啟動自噬，促使腎小管變性，導致腎間質纖維化[3]。在正常腎臟組織內，CTGF表達很低或無表達；在病理狀態下，CTGF可促進成纖維細胞增生、移動、黏附，加快ECM增生及小管上皮細胞轉化[4]。在CTGF啟動子的激活過程中，TGF-β1是最重要的激活因子，可通過Smad3介導而誘導CTGF表達[5]。另一方面，CTGF作為TGF-β1的下游信號因子反作用于TGF-β1，加速其致纖維化進程[6]。白芍總苷(TGP)是從白芍干燥根中提取的混合物，具有抗炎、抗氧化、免疫活性調節等作用。2015年6～8月，我們對DN模型大鼠給予不同劑量TGP進行治療，觀察其對腎組織TGF-β1、CTGF表達的影響，探討TGP對DN大鼠的腎臟保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠60只，體質量(230±10)g，由右江民族醫學院實驗動物室提供，適應性喂養1周。TGP(寧波立華制藥有限公司，用前溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中)，STZ(北京博愛港商貿有限公司)；尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)檢測試劑盒(上海科華生物工程有限公司)，尿白蛋白、尿蛋白檢測試劑盒(武漢博士德有限公司)；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(武漢博士德有限公司)。

1.2 模型制備與分組處理 隨機選取50只大鼠，給予STZ 60 mg/kg腹腔注射。其余10只作為正常對照組，腹腔注射等量生理鹽水。DN造模成功的標準：STZ腹腔注射72 h后空腹血糖13.8～25 mmol/L，2周后24 h尿白蛋白排泄率高于對照組，且24 h尿蛋白定量大于造模前的50%。排除實驗過程中死亡的大鼠，將造模成功的大鼠隨機分成DN組及TGP低、中、高劑量組各9只。TGP低、中、高劑量組分別給予TGP 50、100、200 mg/kg灌胃，按大鼠體質量計算TGP劑量后溶于2 mL的1%羧甲基纖維素鈉溶液中；正常對照組和DN組給予1%的羧甲基纖維素鈉溶液2 mL灌胃，均1次/d。

1.3 指標觀察方法

1.3.1 體質量、血糖及腎功能檢測 每周使用DT-2000型電子天平檢測大鼠體質量，使用血糖儀監測大鼠空腹血糖。實驗8周后，禁食不禁水，留取各組大鼠24 h尿液，使用日本Olympus AU-2700型全自動生化分儀檢測24 h尿蛋白定量;取尾靜脈血，檢測BUN、SCr。

1.3.2 腎組織TGF-β1、CTGF表達檢測 采用免疫組化方法。取大鼠腎組織置于4%多聚甲醛中固定，常規梯度脫水、石蠟包埋后，切4 μm厚切片，常規脫蠟、水化、組織抗原修復，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10 min。依次加入一抗、二抗，37 ℃靜置30 min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。每只大鼠制片3張，采用Image-Pro Plus 6.0彩色病理圖像分析軟件。計算每張片上每個腎小球陽性染色的積分光密度(IOD)，取平均值。

2 結果

2.1 各組體質量、血糖及腎功能比較 與正常對照組相比，DN組體質量降低、血糖升高、24 h尿蛋白定量升高、BUN升高(P均<0.01)。與DN組比較，TGP各劑量組血糖、體質量、Scr均無統計學差異，TGP各劑量組BUN均降低(P均<0.01)；TGP高劑量組24 h尿蛋白定量較DN組降低(P<0.01)，低、中劑量組24 h尿蛋白定量與DN組比較無統計學差異。見表1。

表1 各組體質量、血糖及腎功能比較±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與DN組比較，△P<0.01。

2.2 各組腎組織TGF-β1、CTGF表達比較 與正常對照組相比，DN組腎組織TGF-β1、CTGF表達升高(P均<0.01)，TGP中、高劑量組TGF-β1、CTGF表達降低(P均<0.01)；與DN組比較，TGP中、高劑量組CTGF、TGF-β1表達降低(P<0.05或<0.01)；TGP低劑量組TGF-β1、CTGF表達降低，但差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組腎組織TGF-β1、CTGF表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與DN組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

DN早期主要表現為持續微量白蛋白尿、腎小球基底膜增厚、系膜基質增多，繼而導致腎小球硬化及腎間質纖維化。研究發現，腎小球纖維化和腎間質纖維化是慢性腎臟疾病進展成為終末期腎病的共同通路[7]。DM患者體內炎癥因子、黏附因子及趨化因子表達增加，巨噬細胞在以上因子的誘導下活化，繼而產生多種炎癥因子和細胞因子，造成腎小球的血管內皮細胞損傷、基底膜受損、系膜細胞增生、系膜基質增多，使腎損傷不斷進展，最終導致腎小球纖維化。在促纖維化細胞因子的作用下，腎小球系膜區的ECM增多，腎小球硬化隨之產生，腎臟逐漸失去正常的生理功能。TGF-β1在成纖維細胞增殖、上皮細胞分化及ECM合成等環節中起重要作用，能夠促進膠原與基質形成并抑制其降解。細胞因子CTGF是重要的促組織纖維化蛋白，在結締組織的合成與降解、成纖維細胞的增殖、遷移、黏附以及ECM表達均起重要作用[8]。Gore-Hyer等[9]發現，CTGF可通過介導人系膜細胞表達膠原蛋白使ECM沉積，誘導糖蛋白表達使上皮細胞轉化為間皮細胞，在DN腎纖維化進程中發揮重要作用。CTGF是介導TGF-β1的早期即刻基因[10]，CTGF作為其下游信號因子發揮促纖維化作用，TGF-β1和CTGF在許多纖維化疾病中表達同步增高。近期研究表明，通過抑制TGF-β1/Smads信號通路及其下游CTGF因子的表達，可能改善DM大鼠癥狀并保護其腎組織[11]。本研究顯示，與正常對照組相比，DN組腎組織中TGF-β1、CTGF表達增加，提示二者在腎組織中的表達與DN的腎臟病理改變密切相關。

TGP為毛莨科植物白芍內提取成分，其主要成分為芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷等，具有鎮痛、鎮靜、抗驚厥、抗炎、保肝以及多途徑抑制自身免疫反應等多種藥理作用。動物實驗表明，TGP能抑制DM大鼠腎組織中炎癥因子及細胞因子的表達，起到保護腎臟的作用[12，13]。Wu等[14]認為，TGP可減少DM大鼠AER、抑制腎組織ECM蛋白Ⅳ型膠原的產生，對DM大鼠的腎小管間質損傷起到明顯的治療作用。袁亮等[15]研究表明，TGP可降低DM大鼠的24 h尿白蛋白排泄率，抑制腎組織ECM蛋白Ⅳ型膠原產生；其機制可能是通過抑制TGF-β1表達來抑制腎小管間質細胞轉化過程，從而延緩DN的纖維化進程。鄒曉榮等[16]報道，DN患者在常規治療的基礎上加用TGP膠囊治療6個月后，患者24 h尿蛋白定量減少，肌酐清除率上升，生活質量明顯改善。

本研究顯示，對DN大鼠采用不同劑量TGP干預治療后；BUN均下降,高劑量組24 h尿蛋白定量減少。推測TGP可能通過減輕炎癥反應、減輕足細胞的損傷，從而減少蛋白尿的排泄，改善DN大鼠的腎功能。與正常對照組相比，DN組Scr雖有所升高，但差異無統計學意義，可能與檢測前大鼠長時間禁食導致代謝減少有關，也可能是實驗觀察時間較短，大鼠腎功能的喪失尚不足以導致Scr明顯降低。免疫組化結果提示，中、高劑量組腎組織TGF-β1、CTGF較DN組下降，提示TGP可下調TGF-β1、CTGF表達，從而起到保護腎臟的作用。表明TGP可以減少尿蛋白，降低血清BUN，達到改善腎功能、保護腎臟的作用，其機制可能與下調TGF-β1、CTGF表達有關。

綜上所述，TGP對DN大鼠具有治療作用，可改善腎功能，下調TGF-β1、CTGF在腎組織中的表達，起到保護腎臟、延緩DN進展的作用

[1] Arora MK， Singh UK. Molecular mechanisms in the pathogenesis of diabetic nephropathy: an update[J]. Vascul Pharmacol, 2013,58(4):259-271.

[2] 車麗雙,黃榮桂.TGF-β1與CTGF在腎間質纖維化中的作用[J].醫學綜述,2013,19(4):624-626.

[3] Xu Y, Yang S, Huang J, et al. TGF-β1induces autophagy and promotesapoptosis in renal tubular epithelial cells[J]. Int J Mol Med, 2012,29(5):781-790.

[4] 馬曉燕,閆淵,崔崢.腎衰飲對TGF-β1誘導的下游因子CTGF及FN的調控作用[J].中華中醫藥學刊,2015,33(7):1543-1545.

[5] Nguyen TQ, Tarnow L, Andersen S, et al. Urinary connective tissue growth factor excretion correlates with clinical markers of renal disease in alarge population of type 1 diabetic patients with diabetic nephropathy[J]. Diabetes Care, 2006,29(1):83-88.

[6] 王文文,程錦國.纖維化疾病中的TGF-β/CTGF協同軸[J].山西中醫學院學報,2013,14(1):76-78.

[7] 許艷芳,萬建新.TGF-β1與BMP-7在腎間質纖維化中的作用[J].華夏醫學,2007,20(3):623-626.

[8] Twigg SM, Cooper ME. The time has come to target connective tissue growth factor in diabetic complications[J]. Diabetologia, 2004,47(6):945-968.

[9] Gore-Hyer E, Shegogue D, Markiewicz M, et al. TGF-beta and CTGF have overlapping and distinct fibrogenic effects on human renal cells[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2002,283(4):F707-716.

[10] Grotendorst GR. Connective tissue growth factor:a mediator of TGF-beta action on fibroblasts[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 1997,8(3):171-179.

[11] 賈會玉,李莉,呂磊,等.基于TGF-β1/Smads信號通路探討丹蛭降糖膠囊對糖尿病腎病防治作用[J].中國藥理學通報,2015,31(1):99.

[12] Zhang P, Zhang JJ, Su J, et al. Effect of total glucosides of paeony on the expression of nephrin in the kidneys from diabetic rats[J]. Am J Chin Med, 2009,37(2):295-307.

[13] 蘇靜,吳永貴,張晶晶,等.白芍總苷對糖尿病大鼠腎組織JAK/STAT信號通路的調節作用[J].中國現代醫學雜志,2009,19(3):362-366.

[14] Wu Y, Ren K, Liang C, et al. Renoprotective effect of total glucosides of paeony (TGP) and its mechanism in experimental diabetes[J]. Pharmacol Sci, 2009,109(1):78-87.

[15] 袁亮,吳永貴,郝麗,等.白芍總對糖尿病大鼠腎臟保護作用及部分機制[J].中國藥理學通報,2007,23(6):821-826.

[16] 鄒曉榮,李照輝,羅會文,等.白芍總苷聯合慢性腎衰一體化治療糖尿病腎病療效觀察[J].人民軍醫,2015,58(10):1186-1187.

楊發奮(E-mail: wotanlong@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.011

R587.2

A

1002-266X(2017)06-0035-03

2016-10-12)