香葉醇對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響

江金垚，陳亞麗

(1天津醫科大學第二醫院，天津300211；2河北醫科大學第三醫院)

香葉醇對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響

江金垚1，陳亞麗2

(1天津醫科大學第二醫院，天津300211；2河北醫科大學第三醫院)

目的 研究香葉醇對血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖和遷移的影響，并探討其分子機制。方法 取雄性SD大鼠的胸腹主動脈血管，采用貼塊法分離、培養VSMCs。將細胞分為陰性對照組、對照組、低濃度組及高濃度組，陰性對照組加入無FBS的DMEM培養液，對照組加入含10% FBS的DMEM培養液，低濃度組加入含10% FBS的DMEM培養液及香葉醇50 μmol/L，高濃度組加入含10% FBS的DMEM培養液及香葉醇400 μmol/L。采用MTT法檢測各組細胞增殖情況，細胞劃痕實驗觀察細胞遷移能力，Western blot法檢測Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路的表達。結果 對照組細胞增殖的OD值較陰性對照組升高；低、高濃度組OD值低于對照組，且高濃度組低于低濃度組(P均<0.05)；對照組遷移細胞數較陰性對照組增加，低、高濃度組遷移細胞數少于對照組，且高濃度組少于低濃度組(P均<0.05)；對照組Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路激活較陰性對照組明顯；低、高濃度組與對照組相比Ras-MEK1/2- ERK1/2信號通路激活受抑制，且高濃度組較低濃度組抑制效應更明顯(P均<0.05)。結論 香葉醇可抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖和遷移，其機制之一可能是抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的激活。

香葉醇；血管平滑肌細胞；細胞增殖；細胞遷移；Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路；絲裂原活化蛋白激酶

冠心病患者經皮冠狀動脈介入治療(PCI)術后易發生支架內再狹窄(ISR)。PCI術后血管平滑肌的增殖與遷移形成新生內膜，加上各種炎性細胞募集，細胞外基質合成，最終導致ISR發生。盡管藥物洗脫支架的應用已大幅減少ISR風險，但其發生率仍超過10%[1]。香葉醇是一種植物單萜醇，具有抗細胞增殖[2]、誘導細胞凋亡[3]、阻滯細胞周期[4]、抗氧化應激[5]、降低血漿TG和TC[6]及抑制脂肪代謝相關酶表達[7]等作用，可發揮抗動脈粥樣硬化的心血管保護作用。Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的經典通路之一，對細胞信號傳導、細胞周期調控、細胞增殖和遷移起重要作用。2016年，我們觀察了香葉醇對大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖及遷移的影響，并檢測Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路，以Ras表達增加及MEK1/2、ERK1/2磷酸化程度增加達到統計學差異為激活狀態標準，觀察其激活情況，探討其可能的分子機制，為預防和治療ISR提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠，體質量80～100 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。香葉醇(Sigma公司，美國)；胎牛血清(FBS)；DMEM培養基；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美國)；MTT試劑盒(Millipore，美國)；抗Ras、MEK1/2、P-MEK1/2、ERK1/2、P-ERK1/2、β-actin抗體(Cell Signaling Technology，美國)，抗兔第二抗體(Rockland公司，美國)。

1.2 VSMCs的分離和培養 將大鼠常規處死，取胸腹主動脈血管，分離血管周圍組織，縱向剖開血管，剪成表面積0.5～1 mm2的組織塊，平鋪于含FBS的無菌培養瓶底部，37 ℃、5% CO2培養箱孵育7 d，待細胞融合至80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取3～6代細胞進行實驗。

1.3 細胞分組與處理 細胞生長至80%融合后，換用無FBS的DMEM培養液饑餓培養16 h，使細胞處于靜止期。將細胞分為4組，陰性對照組繼續用無FBS的DMEM培養液培養，對照組加入含10% FBS的DMEM培養液，低濃度組加入含10% FBS的DMEM培養液+香葉醇50 μmol/L，高濃度組加入含10% FBS的DMEM培養液+香葉醇400 μmol/L。

1.4 細胞增殖能力觀察 采用MTT法。四組細胞處理24、48 h后，每孔加入MTT 5 mg/mL 40 μL，37 ℃、5% CO2孵育4 h，棄培養液，每孔加入二甲基亞砜100 μL，振蕩10 min，置酶標儀上，于490 nm波長處測各孔吸光度OD值。

1.5 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。四組細胞處理24、48 h后，用無菌吸頭在細胞生長至80%融合的6孔板上劃一細痕。PBS洗去被刮下的細胞，繼續培養24 h，低倍鏡下觀察細胞遷移情況。任取3個視野計數遷移細胞數量。

1.6 Ras-MEK1/2-ERK1/2相關通路蛋白檢測 采用Western blot法。四組細胞培養48 h后，PBS洗滌，刮取細胞，加入PBS，離心棄上清。加入細胞裂解液裂解細胞，再以超聲波粉碎細胞，離心收集上清。加入蛋白酶抑制劑，按照BCA試劑盒說明測定上清液中的蛋白濃度，收集上清蛋白樣品-80 ℃保存待用。配制12% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，蛋白樣品與2×上樣緩沖液1∶1混合，沸水浴10 min，上樣至凝膠孔，進行SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳，5%脫脂奶粉封閉2 h，依次加入一抗(1∶200)、二抗(1∶2 000)，室溫孵育，TBST洗膜，加發光劑顯色，Bio-Rad Geldoc 2000圖像分析儀進行掃描分析。以Ras蛋白與內參β-actin的比值表示Ras的相對表達量，以磷酸化MEK通路(P-MEK)蛋白與總的MEK通路(T-MEK)蛋白的比值表示MEK的磷酸化程度，以磷酸化ERK通路(P-ERK)蛋白與總的ERK通路(T-ERK)蛋白的比值表示ERK的磷酸化程度。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 與陰性對照組比較，對照組OD值較陰性對照組升高；低濃度組和高濃度組OD值低于對照組，且高濃度組低于低濃度組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖能力比較±s)

注：與陰性對照組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05。

2.2 各組細胞遷移數比較 陰性對照組、對照組、低濃度組、高濃度組細胞遷移數分別為(6.28±1.18)、(57.39±4.81)、(36.11±4.20)、(12.83±2.41)個。對照組較陰性對照組增加，低、高濃度組較對照組減少，高濃度組少于低濃度組(P均<0.05)。

2.3 各組Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路激活水平比較 與陰性對照組比較，對照組Ras信號通路激活明顯，高濃度組和低濃度組Ras信號通路與對照組相比激活受抑制，且高濃度組較低濃度組抑制效應更明顯(P均<0.05)。同樣，對于Ras信號通路下游的MEK1/2和ERK1/2信號通路，對照組發生明顯磷酸化，低、高濃度組磷酸化受抑制，且高濃度組較低濃度組抑制效應更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組Ras信號通路表達及MEK1/2、ERK1/2信號通路磷酸化程度比較±s)

注：與陰性對照組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；與低濃度組比較，cP<0.05。

3 討論

PCI術后ISR的發生機制較復雜，目前一般認為是由于球囊擴張破壞粥樣硬化斑塊，致血小板黏附、聚集和激活，活化的血小板釋放多種細胞因子、趨化因子和生長因子，引發平滑肌細胞增生、白細胞募集和凝血瀑布激活，平滑肌細胞由收縮狀態 轉變為合成狀態，在血管中膜開始增殖，并逐漸由中膜遷移到內膜，隨后形成新生內膜，各種炎性細胞如單核細胞、T細胞和少量B細胞在這一過程中被募集，再加上透明質酸、膠原蛋白等細胞外基質的合成，最終導致ISR的發生[8,9]。ISR實際上是局部血管損傷后的再修復過程，這個過程涉及血管彈性回縮、血栓形成、炎癥因子活化以及血管平滑肌細胞增殖和凋亡[10]。

天然香葉醇能夠通過抑制細胞遷移、下調增殖細胞核抗原(PCNA)表達、抑制Ras-ERK信號通路磷酸化、抑制活性氧生成等途徑抑制細胞增殖以及抑制B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因家族蛋白等途徑誘導細胞凋亡[2，11]，抑制腫瘤細胞生長。最新研究顯示，香葉醇可通過減少血漿TG、TC及抑制脂肪代謝相關酶表達發揮其抗動脈粥樣硬化的作用[6，7]。本研究發現，香葉醇能顯著抑制大鼠VSMCs增殖和遷移，且隨著濃度增高，抑制效應更趨明顯。同時發現，香葉醇能抑制增殖相關Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的激活，且隨濃度增高，抑制效應更明顯。Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路是MAPK的經典通路，在細胞信號傳導、細胞周期調控中起重要作用[12]。在這一通路中，Ras是上游信號蛋白，引導細胞周期由G1期進入S期，而ERK1/2對細胞增殖和遷移至關重要[13]。多種細胞因子、生長因子、炎癥因子等刺激信號，激活Ras原癌基因所介導的Ras-MEK1/2-ERK1/2信號傳導通路，引起ERK1/2發生磷酸化激活，導致細胞周期蛋白Cyclin D等合成增加，引起蛋白合成和細胞增殖[14]。

綜上所述，香葉醇具有抑制大鼠VSMCs增殖和遷移的作用，其機制與抑制增殖相關Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路激活有關,為香葉醇用于預防ISR提供了理論依據。

[1] Giacoppo D, Gargiulo G, Aruta PT, et al. Treatment strategies for coronary in-stent restenosis: systematic review and hierarchical Bayesian network meta-analysis of 24 randomised trials and 4880 patients[J]. BMJ, 2015,351(6364):1-18.

[2] Wittig C, Scheuer C, Parakenings J, et al. Geraniol suppresses angiogenesis by downregulating vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGFR-2 signaling[J]. PLoS One, 2015,10(7):e0131946.

[3] Galle M, Crespo R, Kladniew BR, et al. Suppression by geraniol of the growth of A549 human lung adenocarcinoma cells and inhibition of the mevalonate pathway in culture and in vivo: potential use in cancer chemotherapy[J]. Nutr Cancer, 2014,66(5):888-895.

[4] Kim SH, Bae HC, Park EJ, et al. Geraniol inhibits prostate cancer growth by targeting cell cycle and apoptosis pathways[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,407(1):129-134.

[5] Jayachandran M, Chandrasekaran B, Namasivayam N. Geraniol attenuates oxidative stress by Nrf2 activation in diet-induced experimental atherosclerosis[J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol, 2015,26(4):335-346.

[6] Galle M, Kladniew BR, Castro MA, et al. Modulation by geraniol of gene expression involved in lipid metabolism leading to a reduction of serum-cholesterol and triglyceride levels[J]. Phytomedicine, 2015,22(7/8):696-704.

[7] Jayachandran M, Chandrasekaran B, Namasivayam N. Effect of geraniol，a plant derived monoterpene on lipids and lipid metabolizing enzymes in experimental hyperlipidemic hamsters[J]. Mol Cell Biochem, 2015,398(1/2):39-53.

[8] Jolly K, Gill P. Ethnicity and cardiovascular disease prevention: practical clinical considerations[J]. Curr Opin Cardiol, 2008,23(5):465-470.

[9] Yin RX, Yang DZ, Wu JZ. Nanoparticle drug- and gene-eluting stents for the prevention and treatment of coronary restenosis[J]. Theranostics, 2014,4(2):175-200.

[10] Guildford AL, Stewart HJ, Morris C, et al. Substrate-induced phenotypic switches of human smooth muscle cells: an in vitro study of in-stent restenosis activation pathways[J]. J R Soc Interface, 2011,8(58):641-649.

[11] Chaudhary SC, Siddiqui MS, Athar M, et al. Geraniol inhibits murine skin tumorigenesis by modulating COX-2 expression，Ras-ERK1/2 signaling pathway and apoptosis[J]. J Appl Toxicol, 2013,33(8):828-837.

[12] Raman M, Chen W, Cobb MH. Differential regulation and properties of MAPKs[J]. Oncogene， 2007,26(22):3100-3112.

[13] Roberts PJ, Der CJ. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer[J]. Oncogene, 2007,26(22):3291-3310.

[14] Roovers K, Davey G, Zhu X, et al. Alpha5beta1 integrin controls cyclin D1 expression by sustaining mitogen-activated protein kinase activity in growth factor-treated cells[J]. Mol Biol Cell, 1999,10(10):3197-3204.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.009

R541.4

A

1002-266X(2017)06-0029-03

2016-06-15)