大蒜素對肺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

梁宗英，張樂，侯繼申，張志民，辛國華

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

·基礎(chǔ)研究·

大蒜素對肺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

梁宗英，張樂，侯繼申，張志民，辛國華

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

目的 探討大蒜素對人肺癌H460細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)人肺癌H460細(xì)胞，分為5組，分別加入0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L大蒜素，每個(gè)濃度分別培養(yǎng)24、48、72 h，酶標(biāo)儀測量吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率；將0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L大蒜素加入H460細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后采用碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 同濃度大蒜素作用的H460細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間越長，細(xì)胞增殖率越低(P均<0.01)；同等培養(yǎng)時(shí)間下，H460細(xì)胞增殖率隨大蒜素濃度增高而降低(P均<0.01)；H460細(xì)胞增殖率與大蒜素濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.18，-0.31，-0.72，P均<0.05)。H460細(xì)胞凋亡率隨大蒜素濃度增加而增高(P<0.01)；H460細(xì)胞凋亡率與大蒜素濃度呈正相關(guān)(r=0.31，P<0.05)。結(jié)論 大蒜素能夠降低人肺癌H460細(xì)胞的增殖率，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，具有良好的抗腫瘤作用。

肺癌；大蒜素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

肺癌患者的病死率居惡性腫瘤首位，且其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年增高，嚴(yán)重威脅人類健康。多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已屬晚期，因此該病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷對治療方案的選擇、疾病的預(yù)后等均具有重要意義[1]。大蒜素是從蒜的球形鱗莖中提取的揮發(fā)性油狀物，是二烯丙基三硫化物、二烯丙基二硫化物以及甲基烯丙基二硫化物等的混合物，其中的三硫化物對病原微生物有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，二硫化物也有一定的抑菌和殺菌作用。大蒜素既往在對抗病毒、細(xì)菌以及真菌感染中應(yīng)用較多。近年研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素?zé)o論在體內(nèi)還是在體外，均能有效抑制腫瘤生長。目前關(guān)于大蒜素對消化系統(tǒng)惡性腫瘤作用的研究較多[2，3]，對肺癌作用的研究相對較少。2014年6月～2015年5月，我們觀察了大蒜素對人肺癌H460細(xì)胞增殖和凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 H460細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫提供，大蒜素注射液購自正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。將大蒜素注射液用RPMI1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)配置成100 mmol/L的大蒜素溶液，0 ℃避光保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用完全培養(yǎng)基對H460細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每2日更換1次液體，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底面積的80%、處于對數(shù)生長期時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，以1×105/mL接種于50 mL培養(yǎng)瓶中。

1.3 大蒜素對H460細(xì)胞增殖的影響觀察 取對數(shù)生長期H460細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，接種于96孔板上，2% CO2、37 ℃培養(yǎng)6～12 h。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為5組，分別加入0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L大蒜素，培養(yǎng)24、48、72 h，每時(shí)點(diǎn)設(shè)4個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液。培養(yǎng)終止時(shí)，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜100 μL，置于微孔板振蕩器震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于570 nm處測定各孔吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。以0 μmol/L大蒜素為空白對照組，細(xì)胞增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.4 大蒜素對H460細(xì)胞凋亡的影響觀察 取對數(shù)生長期H460細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種于6孔板，分別加入0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L大蒜素。2% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后離心，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入碘化丙啶，避光染色15 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素對H460細(xì)胞增殖的影響 相同濃度下，隨大蒜素作用時(shí)間延長，細(xì)胞增殖率降低；相同培養(yǎng)時(shí)間下，隨大蒜素濃度增加，細(xì)胞增殖率降低。相關(guān)性分析顯示，24、48、72 h時(shí)H460細(xì)胞增殖率與大蒜素濃度均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.18、-0.31、-0.72，P均<0.05)。見表1。

表1 大蒜素對肺癌H460細(xì)胞增殖率的影響±s)

注：與12.5 μmol/L比較，aP<0.01；與25.0 μmol/L比較，bP<0.01；與50.0 μmol/L比較，cP<0.01。

2.2 大蒜素對H460細(xì)胞凋亡的影響 0、12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L大蒜素作用后，H460細(xì)胞凋亡率分別為0.44%±0.21%、8.52%±1.42%、12.51%±1.65%、28.66%±3.47%、39.21%±5.76%，隨大蒜素濃度增加，細(xì)胞凋亡率增高(F=98.02，P<0.01)。100.0 μmol/L組H460細(xì)胞凋亡率高于50.0 μmol/L組，50.0 μmol/L組高于25.0 μmol/L組，25.0 μmol/L組高于12.5 μmol/L組，12.5 μmol/L組高于0 μmol/L組(P均<0.01)。相關(guān)性分析顯示，H460細(xì)胞凋亡率與大蒜素濃度呈正相關(guān)(r=0.31，P<0.05)。

3 討論

大蒜是百合科蔥屬的一種多年生草本植物的地下球形鱗莖，可通過其所含的多種含硫化合物起到較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，維持其完整性[4]。大蒜素是大蒜中最主要的含硫化合物。研究表明，大蒜素具有一定的防癌、抗癌作用。其抗腫瘤機(jī)制主要包括：直接殺傷腫瘤細(xì)胞、提高CAMP水平、阻斷致癌物質(zhì)的合成、對抗突變、影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化等[5]，也可通過免疫干擾影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖等過程，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用[6]。Munday等[7]認(rèn)為，大蒜素的抗癌作用與人體組織的苯醌還原酶活性存在密切關(guān)系，而苯醌還原酶能夠參與致癌物質(zhì)苯丙芘仲苯醌的解毒反應(yīng)，大蒜素能夠誘導(dǎo)苯醌還原酶激活并提高其活性，從而起到抑制腫瘤生長的作用。已有研究證實(shí)，大蒜素對胃癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用。

本研究觀察了大蒜素對人肺癌H460細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖率隨大蒜素濃度增加、培養(yǎng)時(shí)間延長而降低，細(xì)胞凋亡率隨大蒜素濃度增加而增高。表明大蒜素能夠有效抑制H460細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。其機(jī)制可能與大蒜素的下列作用有關(guān)：①影響致癌物質(zhì)的合成。亞硝酸鹽是致癌物質(zhì)亞硝胺的前體物，大蒜素能夠降低亞硝酸鹽含量，從而降低癌癥發(fā)病率[8]。乙烯雌酚也具有較強(qiáng)的致癌作用，大蒜素能夠直接抑制已烯雌酚的代謝，降低乙烯雌酚導(dǎo)致的惡性腫瘤的發(fā)生率[9]。②對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用。大蒜素能夠抑制胃癌相關(guān)細(xì)胞的生長，且該抑制作用與大蒜素濃度呈正相關(guān)[10]。③對抗氧自由基。部分毒性物質(zhì)、致癌物質(zhì)均可通過氧化性損傷導(dǎo)致細(xì)胞基因的穩(wěn)定性改變甚至導(dǎo)致細(xì)胞癌變，大蒜素能夠?qū)苟拘晕镔|(zhì)對機(jī)體的氧化損傷，發(fā)揮其抗腫瘤作用。④藥物增敏、抗耐藥：在惡性腫瘤的藥物治療過程中，若適當(dāng)調(diào)整抗癌藥物與大蒜素的劑量，能夠更好地發(fā)揮抗癌藥物的抗癌作用[11]，推測大蒜素可能具有化療藥物增敏作用，或通過某種途徑降低化療藥物耐受情況。⑤免疫調(diào)節(jié)：大蒜素能夠提高機(jī)體自然殺傷細(xì)胞活性及體內(nèi)IL-2水平，從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞分裂、增生，并增強(qiáng)其活性[12]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤的發(fā)展過程。

綜上所述，大蒜素能夠降低人肺癌H460細(xì)胞的增殖率，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，從而起到良好的抗腫瘤作用。本研究僅為體外實(shí)驗(yàn)研究，關(guān)于大蒜素對肺癌的作用，尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)。

[1] 陳萬青,張思維,鄒小農(nóng),等.2004～2005年中國肺癌死亡情況分析[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2010,44(5):378.

[2] 陳傳軍,于志堅(jiān),呂亞莉,等.大蒜素抗人肝癌 HepG-2 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014,32(7):1763-1767.

[3] Raghu R, Lu KH, Sheen LY. Recent research progress on garlic (dà suàn) as a potential anticarcinogenic agent against major digestive cancers[J]. J Tradit Complement Med, 2012,2(3):192-201.

[4] Lee JH, Khor TO, Shu L, et al. Dietary phytochemicals and cancer prevention: Nrf2 signaling, epigenetics, and cell death mechanisms in blocking cancer initiation and progression[J]. Pharmacol Ther, 2013,137(2):153-171.

[5] 蔣淑婉,李云.大蒜素的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(8):1420-1422.

[6] 張逸平,李正祎.IL-24聯(lián)合大蒜素體外抗肺癌細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,17(3):335-338.

[7] Munday R, Munday CM. Relative activities of organosulfur compounds derived from onions and garlic in increasing tissue activeties of quinine reductase and glutathione transferase in rat tissues[J]. Nutr Cancer, 2001,40(2):205-210.

[8] 夏磊,周玲,崔淑香,等.大蒜素誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的探討[J].中華腫瘤防治雜志,2010,16(8):32-35.

[9] Green M, Thomas R, Gued L, et al. Inhibition of DES-induced DNA adductsbydiallylsulfide: implications in liver cancer prevention[J]. Oncol Rep, 2003,10(3):767-771.

[10] 馬利劍,任明姬,田云鵬,等.大蒜素抗胃癌作用及其機(jī)制的探討[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2016,13(3):183-186.

[11] Arora A, Seth K, Shukla Y, Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by diallyl sulfide in K562 leukemic cells and in mouse liver[J]. Carcinogenesis,2004,25(6):941-949.

[12] 劉巍,王智新,湯艷文,等.大蒜素對體外培養(yǎng)宮頸癌U14細(xì)胞增殖及荷瘤小鼠免疫功能的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,29(5):496-497.

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20157049)。

辛國華(E-mail: xgh067000@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.008

R734.2

A

1002-266X(2017)06-0027-03

2016-10-31)