針刺對血管性癡呆大鼠前額葉皮層氧化應(yīng)激及神經(jīng)元損傷的影響

杜斯琪，王雪蕊，朱雯，姬彩碩，李天然，肖凌勇，劉存志

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針刺對血管性癡呆大鼠前額葉皮層氧化應(yīng)激及神經(jīng)元損傷的影響

杜斯琪，王雪蕊，朱雯，姬彩碩，李天然，肖凌勇，劉存志

首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，針灸神經(jīng)調(diào)控北京市重點實驗室，北京 100010

目的 觀察針刺對慢性腦低灌注大鼠前額葉皮層氧化應(yīng)激及神經(jīng)元損傷的影響，探討針刺改善血管性癡呆（VD）大鼠認知損害的分子機制。方法 采用永久性雙側(cè)頸動脈結(jié)扎法造成大鼠慢性腦低灌注復制VD模型，造模后大鼠隨機分為模型組、針刺組和非穴組，同時設(shè)假手術(shù)組作為對照。針刺組和非穴組造模后3 d針刺治療，2周后灌注取材。尼氏染色檢測前額葉皮層神經(jīng)元數(shù)量，DHE染色檢測活性氧（ROS）含量，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果 模型組神經(jīng)元數(shù)量、SOD活性較假手術(shù)組降低，ROS含量升高；針刺組神經(jīng)元數(shù)量和SOD活性較模型組明顯升高、ROS含量降低，同時非穴組各指標未見明顯改善。結(jié)論 針刺可抑制VD大鼠前額葉皮層的氧化應(yīng)激水平，改善神經(jīng)元損傷和丟失。

針刺；血管性癡呆；氧化應(yīng)激；神經(jīng)元損傷；活性氧；超氧化物歧化酶；大鼠

血管性癡呆（VD）是常見呆病，表現(xiàn)為腦血流減少，認知功能進行性下降。臨床上對VD尚無明確的診斷和治療標準[1]。有研究顯示，永久性雙側(cè)頸動脈結(jié)扎（2VO）造成的大鼠慢性腦低灌注是最常用的VD模型[2]。造模后皮層神經(jīng)元損傷和丟失、白質(zhì)損傷等病理改變均與認知功能損害密切相關(guān)[3]。本課題組前期研究表明，針刺能明顯改善VD大鼠學習記憶[4-5]。本研究采用2VO模型，觀察針刺對VD大鼠前額葉皮層氧化應(yīng)激水平的影響，探討其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 動物

10周齡SPF級雄性大鼠48只，體質(zhì)量300～320 g，北京市維通利華技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院基礎(chǔ)理論研究所SPF級動物實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

焦油紫染色液（上海碧云天生物技術(shù)公司），活性氧（ROS）試劑盒（美國GENMED公司），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。冰凍切片機（德國Leica公司），DHG-9023A烤箱（上海林頻儀器有限公司），光學顯微鏡（日本Olympus），一次性無菌針灸針（華佗牌，0.25 mm×13 mm）。

1.3 造模與分組

采用2VO大鼠復制VD模型[6]，另隨機取12只大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組手術(shù)過程與造模一致，但雙側(cè)頸總動脈不結(jié)扎。造模成功大鼠隨機分為模型組、針刺組和非穴組，每組12只。

1.4 干預

針刺組和非穴組于造模后3 d針刺治療，其中針刺組選取“百會”和雙側(cè)“足三里”捻轉(zhuǎn)補法各30 s，之后不留針，取穴位置參照文獻[7]，非穴組參照文獻[8-9]取常用非穴點（雙脅肋下髂棘直上10 mm）行無行針手法的淺刺不留針。以上治療每日1次，連續(xù)6 d休息1 d，共12次。另外假手術(shù)組、模型組和非穴組進行與針刺組相同時間和手法的捉抓刺激。

1.5 取材及處理

末次針刺后第2日，大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉，每組取5只大鼠4%多聚甲醛固定，并取出全腦，蔗糖梯度脫水后冰凍切片（厚度10 μm）；剩余大鼠直接斷頭后分離前額葉皮層，-80 ℃冰箱保存。

1.6 神經(jīng)元損傷檢測

將切片置于50 ℃焦油紫染色液中孵育45 min，用蒸餾水沖洗除去浮色，再用乙醇梯度脫水、二甲苯透明，最后用中性樹脂及蓋玻片封片，鏡下觀察皮層神經(jīng)元改變。

1.7 活性氧含量測定

室溫下將切片滴加DHE試劑避光孵育30 min，封片后用熒光顯微鏡觀察，其中激發(fā)波長為540 nm，發(fā)射波長為590 nm。

1.8 超氧化物歧化酶活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法測定，按照SOD試劑盒說明書操作，用分光光度儀測定。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±表示，采用方差分析。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺對大鼠前額葉皮層神經(jīng)元的影響

與假手術(shù)組比較，模型組皮層神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，且細胞形態(tài)固縮或不規(guī)則；針刺組神經(jīng)元數(shù)量增加（＜0.05），且形態(tài)固縮的神經(jīng)元減少；而非穴組與模型組比較無明顯差異。結(jié)果見圖1、圖2。

假手術(shù)組模型組 針刺組非穴組

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05（下同）

2.2 針刺對大鼠前額葉皮層活性氧含量的影響

鏡下DHE染色的目的熒光呈紅色，假手術(shù)組未見明顯陽性染色。模型組較假手術(shù)組ROS含量明顯升高（＜0.05），針刺組較模型組ROS含量明顯降低（＜0.05）。結(jié)果見圖3、圖4。

假手術(shù)組模型組 針刺組非穴組

2.3 針刺對大鼠前額葉皮層超氧化物歧化酶活性的影響

與假手術(shù)組比較，模型組皮層SOD活性明顯下降（＜0.05）；與模型組比較，針刺組SOD活性顯著升高（＜0.05），非穴組未見明顯差異。結(jié)果見圖5。

3 討論

VD屬中醫(yī)學“呆癥”范疇，其病位在腦。臨床上針刺治療癡呆多采用遠近配穴，頭部最常取的穴位是百會，肢體穴位最常用足三里，其中百會內(nèi)入絡(luò)腦，足三里助化生氣血以濡養(yǎng)腦髓，兩穴相配能夠益腎健腦調(diào)神。另外，非穴組取文獻中常用的非經(jīng)非穴點，以凸顯針刺的特異性效應(yīng)[8-9]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，針刺“足三里”和“百會”能明顯改善慢性腦低灌注引起的大鼠學習記憶損害，而非穴治療并無改善作用[4]。2VO造成的慢性腦低灌注可引起全腦慢性、廣泛性的缺血狀態(tài)，能很好地復制VD的病理生理過程。采用雙血管阻斷復制VD模型發(fā)現(xiàn)，腦缺血可導致海馬和皮層的神經(jīng)元死亡、白質(zhì)損傷、膠質(zhì)細胞激活和學習記憶損害，對揭示VD的發(fā)病機制至關(guān)重要。本實驗采用尼氏染色、免疫熒光等方法，發(fā)現(xiàn)造模后1周，皮層神經(jīng)元數(shù)量隨缺血時間的延長而進行性減少，而神經(jīng)元缺失在缺血早期以神經(jīng)元壞死為主，慢性期以凋亡為主[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺能顯著減少2VO引起的大鼠前額葉皮層神經(jīng)元數(shù)量減少，改善神經(jīng)元形態(tài)。

腦缺血導致氧化應(yīng)激是神經(jīng)元損傷與丟失的主要機制。研究表明，頸總動脈結(jié)扎后大鼠腦組織ROS等自由基水平明顯升高[11]，導致蛋白、脂質(zhì)和DNA的氧化性損傷，從而引發(fā)組織細胞損傷。另外，腦缺血也會影響神經(jīng)元內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)。SOD是組織細胞主要的氧化還原調(diào)節(jié)酶，能催化生物體內(nèi)超氧自由基的清除反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，VD大鼠海馬SOD活性較正常大鼠下降[3]，表明SOD活性降低可能是引起VD的重要機制。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺能抑制慢性低灌注引起的大鼠前額葉皮層ROS含量增加SOD活性升高。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)針刺“足三里”“百會”可改善慢性腦低灌注引起的大鼠前額葉皮層神經(jīng)元損傷，抑制氧化應(yīng)激，這可能是其治療VD的機制之一。

[1] O'BRIEN J T, THOMAS A. Vascular dementia[J]. Lancet,2015,386：1698-1706.

[2] JIWA N S, GARRARD P, HAINSWORTH A H. Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment：a systematic review[J]. J Neurochem,2010,115(4)：814-828.

[3] DU S Q, WANG X R, XIAO L Y, et al. Molecular mechanisms of vascular dementia：what can be learned from animal models of chronic cerebral hypoperfusion?[J]. Mol Neurobiol,2016 May 20.

[4] WANG X R, SHI G X, YANG J W, et al. Acupuncture ameliorates cognitive impairment and hippocampus neuronal loss in experimental vascular dementia through Nrf2-mediated antioxidant response[J]. Free Radic Biol Med,2015,89：1077-1084.

[5] SHI G X, WANG X R, YAN C Q, et al. Acupuncture elicits neuroprotective effect by inhibiting NAPDH oxidase-mediated reactive oxygen species production in cerebral ischaemia[J]. Sci Rep,2015,5：17981.

[6] LI H, LIU Y, LIN L T, et al. Acupuncture reversed hippocampal mitochondrial dysfunction in vascular dementia rats[J]. Neurochem Int,2016,92：35-42.

[7] 華興邦,李辭蓉,周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991(1)：1-5.

[8] 林鶯,紀峰,黃桂榕,等.針刺實驗研究中大鼠非經(jīng)非穴選取方法及思考[J].針刺研究,2013,38(4)：334-338.

[9] LI F, YAN C Q, LIN L T, et al. Acupuncture attenuates cognitive deficits and increases pyramidal neuron number in hippocampal CA1 area of vascular dementia rats[J]. BMC Complement Altern Med, 2015,15：133.

[10] FARKAS E, LUITEN P G, BARI F. Permanent, bilateral common carotid artery occlusion in the rat：a model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J]. Brain Res Rev,2007,54(1)：162-180.

[11] CHOI D H, LEE K H, KIM J H, et al. NADPH oxidase 1, a novel molecular source of ROS in hippocampal neuronal death in vascular dementia[J]. Antioxid Redox Signal,2014,21(4)：533-535.

Effects of Acupuncture on Oxidative Stress and Neuronal Damage in Prefrontal Cortex of Vascular Dementia Rats

DU Si-qi, WANG Xue-rui, ZHU Wen, JI Cai-shuo, LI Tian-ran, XIAO Ling-yong, LIU Cun-zhi

Objective To observe the effects of acupuncture on oxidative stress and neuronal damage in the prefrontal cortex of chronic cerebral hypoperfusion (CCH) rats; To investigate the molecular mechanisms of acupuncture in cognitive impairment of vascular dementia (VD) rats. Methods The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion (2VO) to induce CCH in rats. After modeling, rats were randomized into model group, acupuncture group and non-acupoint group. Sham-operation group was set as control group. Rats of acupuncture group and non-acupoint group were treated with needling for 2 weeks at 3 days after 2VO. Nissl and DHE staining were respectively used to evaluate the numbers of neurons and ROS level. SOD activity was examined by xanthine oxidase technique. Results Compared with sham-operation group, the number of neurons and SOD activity decreased in the model group, while the ROS level increased. Compared with the model group, the number of neurons and SOD activity increased in the acupuncture group, while the ROS level decreased. There were no obvious changes in all indexes in non-acupoint group. Conclusion Acupuncture can inhibit oxidative stress and improve neuronal damage and loss in the prefrontal cortex of VD rats.

acupuncture; vascular dementia; oxidative stress; neuronal damage; SOD; ROS; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.013

R245

A

1005-5304(2017)06-0053-03

國家自然科學基金面上項目（81473501）

劉存志，E-mail：lcz623780@126.com

（2017-01-13）

（修回日期：2017-02-07；編輯：華強）