遼東楤木葉總皂苷對人結腸癌HT-29細胞凋亡的影響

尹麗穎，李鳳金，仲麗麗，敖鵬，張妍妍，邊曉燕，唐丹麗

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遼東楤木葉總皂苷對人結腸癌HT-29細胞凋亡的影響

尹麗穎1，李鳳金1，仲麗麗1，敖鵬1，張妍妍1，邊曉燕1，唐丹麗2

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040；2.中國中醫科學院，北京 100700

目的 探討遼東楤木葉總皂苷（ETS）誘導人結腸癌HT-29細胞凋亡及其對凋亡相關蛋白表達的影響。方法 MTT法檢測不同濃度（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg）ETS培養的結腸癌HT-29細胞增殖率，Hoechst33258染色和激光共聚焦成像檢測細胞凋亡，并觀察凋亡細胞的形態學改變，免疫組化檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達。結果 ETS可誘導HT-29細胞發生凋亡，且凋亡作用在一定范圍內呈劑量依賴性；ETS可使HT-29細胞Bcl-2表達降低、Bax表達升高（＜0.05，＜0.01），且呈明顯的量效關系。結論 ETS可誘導HT-29細胞凋亡，其凋亡機制可能與降低Bcl-2、升高Bax的表達相關。

遼東楤木葉總皂苷；HT-29細胞；細胞凋亡；Bcl-2；Bax

隨著我國人民生活水平的提高，全民的膳食結構發生了重大改變，結腸癌的發病率和死亡率也隨之升高[1]。目前除傳統手術、放化療等手段外，中醫藥治療結腸癌越來越受到青睞。本課題組前期研究發現，遼東楤木葉總皂苷（total saponine of Aralia Elata Seem leaves，ETS）具有良好的抗腫瘤作用，且對人結腸癌作用效果明顯，但其作用機制尚不十分明確[2]。本實驗采用MTT法檢測人結腸癌HT-29細胞增殖率，通過Hoechst33258染色、激光共聚焦成像等方法檢測細胞凋亡，觀察ETS對凋亡細胞形態的影響，并用免疫組化檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達，探討ETS對HT-29細胞凋亡的誘導作用及其可能的機制。

1 實驗材料

1.1 藥物和細胞株

ETS由黑龍江中醫藥大學藥理教研室提供；人結腸癌HT-29細胞株由中國醫學科學院基礎醫學研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

MTT（美國Sigma公司，批號0793）；hyclone PRMI-1640培養基（賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司，批號AAJ206662）；胎牛血清（TBD，批號OW20150122-0256）；Hoechst33258熒光染液（碧云天生物技術研究所，批號20131105）；抗Bcl-2抗體（Sant Cruz，批號14H80415）；抗Bax抗體（Sant Cruz，批號14V70207）；S-P Kit試劑盒（福州邁新試劑公司，批號SA1052）。激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司），CO2培養箱（HF90/HF240力新儀器上海有限公司），熒光顯微鏡（德國Leica），電熱恒溫水浴鍋（DK-S24，上海森信實驗儀器有限公司），低速離心機（LDZ4-1.2，北京醫用離心機廠），MILLI-Q超純凈水純化系統（北京同德創業科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

常規培養HT-29細胞至80%～90%融合時，PBS沖洗后加入含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶1 mL消化，低速離心。棄上清液，加入新鮮培養基，分裝后于5%CO2、37 ℃下培養備用。

2.2 細胞增殖檢測

取對數生長期HT-29細胞，調整濃度至1×105/mL，接種于96孔板上，每孔100 μL懸液，每組6個復孔，5%CO2、37 ℃孵育24 h，隨后依次加入不同濃度的ETS加藥培養基（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg），對照組加入等體積空白培養基。48 h后棄培養基，加入MTT溶液，5%CO2、37 ℃孵育4 h，加入DMSO溶液，37 ℃溶解10 min，于酶標儀波長570 nm處測定吸光度（OD），計算細胞抑制率[（1－受試藥組平均OD值÷對照組平均OD值）×100%]。

2.3 細胞核染色

按“2.1”項方法培養細胞。于6孔板中進行細胞爬片，培養24 h后給藥組加入含不同濃度（10、20、40 mg/kg）ETS的1640培養基2 mL，對照組加入等體積1640培養基。培養48 h后，棄培養液，PBS沖洗，4%多聚甲醛0.5 mL固定10 min，PBS沖洗2次，加入Hoechst33258染色液，5 min后PBS沖洗2次，自然晾干，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4 細胞凋亡檢測

按“2.3”項下方法培養細胞。培養48 h后棄培養液，PBS沖洗2次×2 min，加入200 μL Binding Buffer，再加入10 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，室溫避光染色15 min，最后加入300 μL Binding Buffer，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測。

2.5 Bcl-2、Bax表達檢測

按“2.3”項下方法培養細胞。培養48 h后棄培養液，PBS沖洗2次×2 min，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3次×3 min，加入PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫孵育10 min滅活內源酶后，PBS沖洗3次×3 min，隨后加入正常山羊血清封閉液，室溫20 min。沖洗后加入抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體及抗GAPDH抗體（1∶200稀釋），4 ℃過夜，PBS沖洗后加入辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗后DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片、鏡檢。高清晰圖文分析系統對圖像進行分析，以核膜或胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性區域，隨機選取5個400倍視野計算陽性細胞率。

3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以±表示，組間比較采用單因素方差分析。＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 遼東楤木葉總皂苷對人結腸癌HT-29細胞增殖的影響

不同濃度ETS對HT-29細胞有不同程度的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性。50、100、200 mg/kg ETS組較對照組差異有統計學意義（＜0.01）。見表1。

表1 各組人結腸癌HT-29細胞增殖抑制率比較（±s）

注：與對照組比較，*＜0.05，**＜0.01（下同）

4.2 Hoechst33258染色細胞核結果

與對照組細胞核均勻淡藍色比較，經ETS處理后，HT-29細胞核呈亮藍色濃染，說明細胞核染色質發生了固縮，致使細胞核與Hoechst33258的結合能力增強，且隨濃度的增加，亮藍染色的比例增加。結果見圖1。

對照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

4.3 AnnexinV-FITC/PI雙染法細胞凋亡結果

對照組細胞結構完整，呈不規則三角形，無染色或僅有微弱的綠色熒光。經ETS干預24 h后，各組均可見大量凋亡細胞，且隨濃度的增加，凋亡細胞比例升高。早期凋亡的細胞僅在細胞膜處呈綠色熒光，細胞核不著色；中、晚期凋亡的細胞則細胞膜處呈現綠色熒光，細胞核處呈現紅色熒光。結果見圖2。

對照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

4.4 遼東楤木葉總皂苷對人結腸癌HT-29細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的影響

與對照組比較，各濃度ETS組可見Bcl-2蛋白表達顯著降低、Bax蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01），見表2。Bcl-2形態學表現為胞膜及胞漿中棕黃色顆粒減少，見圖3；Bax形態學表現為胞膜及胞漿中棕黃色顆粒增多，見圖4。

表2 各組人結腸癌HT-29細胞Bcl-2、Bax蛋白表達比較（±s）

對照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

圖3 各組人結腸癌HT-29細胞Bcl-2蛋白表達（免疫組化染色，×400）

對照組10 mg/kg ETS組 20 mg/kg ETS組40 mg/kg ETS組

圖4 各組人結腸癌HT-29細胞Bax蛋白表達（免疫組化染色，×400）

5 討論

中藥遼東楤木具有補氣安神、強精滋腎、祛風活血、除濕止痛的功效，可用于治療神經衰弱、風濕性關節炎、肝炎、糖尿病等腎氣不足之證[3]。現代藥理研究顯示，ETS具有抑制癌細胞生長的作用[4]，對人結腸癌HT-29細胞作用尤為顯著[5]。但其是否與誘導細胞凋亡有關尚不明確，本研究通過檢測凋亡相關指標進一步探討其對人結腸癌HT-29細胞的作用機制。

細胞凋亡異常與許多疾病尤其是癌癥的發生發展有著密切關系。近年來，運用細胞凋亡手段研究中藥抗癌機制成為熱點[6-7]。Hoechst33258染色是通過對細胞核染色質進行染色對細胞核的形態進行觀察。本實驗結果顯示，經ETS干預的細胞出現不同程度致密濃染顆粒且在一定范圍內與濃度呈正相關，表明ETS具有誘導人結腸癌HT-29細胞凋亡的作用。

AnnexinV-FITC/PI雙染法是區分凋亡早期及中晚期細胞的有效方法。本實驗結果顯示，不同濃度ETS對HT-29細胞均可產生誘導凋亡的作用，且隨濃度的增加中晚期凋亡細胞增加。

腫瘤的發生、發展與細胞的過度增殖、正常凋亡受到抑制兩個因素相關。因此，研究凋亡相關蛋白的表達成為研究抗腫瘤藥物作用機制的重要途徑之一[8]。Bcl-2是目前發現最重要的抑制腫瘤細胞凋亡的基因，而Bax作為Bcl-2家族的一員，具有Bcl促細胞凋亡功能，Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡[9]。本研究發現，不同濃度ETS能影響HT-29細胞Bcl-2和Bax的表達，其中Bcl-2蛋白表達顯著下降，而Bax蛋白表達顯著上升。

綜上，本研究結果表明，ETS具有誘導人結腸癌HT-29細胞產生凋亡的作用，其機制可能與其調節凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達相關。

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Effects of ETS on Apoptosis of Human Colorectal Cancer HT-29 Cells

YIN Li-ying1, LI Feng-jin1, ZHONG Li-li1, AO Peng1, ZHANG Yan-yan1, BIAN Xiao-yan1, TANG Dan-li2

Objective To study the apoptosis of human colorectal cancer HT-29 cells induced by Aralia elata Seem leaf total saponin (ETS) and its effects on the expression of relevant proteins. Methods MTT assay was used to detect the proliferation of human colorectal cancer HT-29 cells cultivated with different concentrations (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 mg/kg) of ETS. Hoechst33258 staining and laser confocal imaging were used to detect the apoptotic cells. Morphological changes were observed. The expressions of Bcl-2 and Bax were detected by immuno- histochemistry. Results ETS could induce apoptosis of HT-29 cells and apoptosis was in a dose-dependent manner in a certain range. ETS could decrease the expression of Bcl-2 and increase the expression of Bax in HT-29 cells (<0.05,<0.01), showing a significant dose-effect relationship. Conclusion ETS can induce the apoptosis of HT-29 cells, and the mechanism may be related to reducing the expression of Bcl-2 and increasing the expression of Bax.

Aralia elata Seem leaf total saponin; HT-29 cells; cell apoptosis; Bcl-2; Bax

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.012

R285.5

A

1005-5304(2017)06-0049-04

黑龍江中醫藥大學優秀創新人才支持計劃項目（051226）；黑龍江中醫藥大學科研基金項目（201218）；哈爾濱市科技局項目（404S223）

唐丹麗，E-mail：tangdanli@hotmail.com

（2016-06-21）

（修回日期：2016-07-29；編輯：華強）