不同預處理對靈芝多糖提取效果的影響

梁晉誼 周敬豪 周健平 譚毅峰 許克勇

（開平健之源保健食品有限公司，廣東開平529321）

靈 芝為 赤芝 Ganoderma lucidum（Leyss.ex.Fr）Karst的子實體[1]，屬多孔菌科真菌[2]，臨床上可用于輔助化療或放療治療腫瘤，慢性支氣管炎與哮喘，神經衰弱失眠，高血脂癥，高血壓病，糖尿病，肝炎，白細胞減少癥，毒蘑菇中毒等方面治療或輔助治療[3]。靈芝含有多種功效活性成分，其中靈芝多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、保護神經細胞[4]等多方面的生理活性，是靈芝中最重要的活性成分之一，為靈芝保健及藥用價值開發重要的功效物質基礎。

靈芝干燥后多呈近革質或木栓質至木質的結構[5]，子實體菌絲壁厚粗大，交織纏繞，具有由葡聚糖、幾丁質、纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質等構成的四層結構細胞壁，質地堅韌，機械強度高，耐壓、耐溫、耐酸、耐堿，對消化酶也非常穩定，里面的多糖等功效物質難以充分地被提取利用。目前通過提取方法的改進提高靈芝多糖得率的研究及報道較多，但少有對靈芝提取前預處理方式進行研究的。研究對比了不同預處理方式，以及最佳預處理方式結合不同提取方法對靈芝多糖提取效果的影響，旨在尋找一種最優的預處理方法，為靈芝多糖的提取利用研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試靈芝 取自開平健之源保健食品有限公司靈芝基地，烘干處理，經中國科學院微生物研究所鑒定為Ganoderma lucidum靈芝（赤芝），生產批號：160301C。

1.1.2 試劑 葡聚糖標準品，購于中國計量科學研究院；復合纖維素酶（Celluclast），諾維信公司；食用菌水解酶A01、木瓜蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、五水合硫酸銅、檸檬酸鈉、無水硫酸鈉、氨水、無水乙醇、濃硫酸、苯酚，均為分析純。

1.2儀器設備木粒粉碎機，廣東陽山機械廠；爪式粉碎機，廣東陽山機械廠；氣流粉碎機，昆山強威粉體設備有限公司；KQ2200DA型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；P70D20TP-C6（WO）格蘭仕微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，天津市華北實驗儀器有限公司；RE-5205旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司；DZF水式多用型真空干燥箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司；TGL-16B高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；Uvmini-1240紫外可見分光光度計，津島公司；Waters 1525高效液相色譜儀。

1.3方法

1.3.1 靈芝粗粉碎 用木粒粉碎機將靈芝干燥子實體打成粗粒，再用爪式粉碎機將粗粒粉碎，過10目篩網。

1.3.2 靈芝預處理及提取 取經過粗粉碎的靈芝粉末樣品，分別進行以下操作。

1.3.2.1 直接提取 取4份樣品各100 g，分別加入1000 mL水，微沸提取2 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，真空濃縮干燥（溫度：60℃，真空度：-0.090 MPa），得靈芝提取物，計算粗收率、多糖含量及多糖得率。

1.3.2.2 浸泡預處理及提取 取4份樣品各100 g，分別加入1000 mL水，攪拌1 min后靜置，常溫浸泡16 h，然后微沸提取2 h，其它處理同上。

1.3.2.3 微波預處理及提取 取4份樣品各100 g，分別滴加質量比15%的乙醇[6]，邊加邊攪拌均勻，然后置于微波爐中設置中低火處理3 min，取出后加入1000 mL水，微沸提取2 h，其他處理同上。

1.3.2.4 氣流精細粉碎預處理及提取 取20 kg樣品投入氣流粉碎機中進行精細粉碎（進料速度3 kg/h，工作壓力0.8 MPa，設備氣量2 m3/min），過40目篩網，取4份樣品各100 g，加入1000 mL水，微沸提取2 h，其他處理同上。

1.3.3 氣流精細粉碎預處理結合不同方法提取靈芝多糖

1.3.3.1 熱水提取 同1.3.2.4方法。

1.3.3.2 醇提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據前期實驗所得最優條件，分別加入1000 mL 2%乙醇，70℃提取2 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.3.3 堿提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據前期實驗所得最優條件，分別加入1000 mL 1%氨水溶液，微沸提取2 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.3.4 超聲波結合酶提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據前期實驗所得最優條件，分別加入1000 mL水，同時加入0.6 g復合纖維素酶、0.1 g食用菌水解酶A01、0.6 g木瓜蛋白酶，超聲提取1 h，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.3.5 微波提取 取1.3.2.4所得靈芝精粉4份樣品各100 g，根據前期實驗所得最優條件，分別加入1000 mL水，置于微波爐中設置中低火（150 W）提取15 min，過濾收集濾液，濾渣同條件再次提取，合并兩次濾液，其他處理同上。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 粗收率計算 粗收率（%）=靈芝提取物重量（g）/靈芝投料量（g）×100

1.3.4.2 多糖含量測定 分光光度測定法，以葡聚糖為標準品繪制標準曲線[7]。

1.3.4.3 多糖得率計算 多糖得率（%）=粗收率（%）×多糖含量（%）×100

1.3.4.4 多糖高效液相色譜檢測分析

1.3.4.4.1 高效液相色譜檢測 采用凝膠滲透色譜法對樣品中的多糖進行檢測分析。色譜條件：UltrahydrogelTM250 GPC柱，7.8 mmhydrog；流動相為純凈水；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器：2420蒸發光散射檢測器。

1.3.4.4.2 樣品溶液制備 精密稱取1 g試樣（靈芝提取物），加水定容至100 mL，搖勻，濾過，準確吸取濾液5 mL，加入20 mL無水乙醇，醇沉靜置5 min，離心15 min（5000 r/min），去上清，用80%乙醇離心洗滌沉淀物1次，沉淀物定容至5 mL水，作為供試樣品溶液，進樣前用0.45 μm水相針式過濾器過濾。

2 結果與分析

2.1不同預處理方法對靈芝多糖提取效果的影響由表1可知，直接提取與浸泡預處理、微波預處理后提取相比，粗收率、多糖含量、多糖得率的變化均較小，即浸泡預處理及微波預處理對靈芝多糖提取效果的影響不明顯，而氣流精細粉碎預處理能大幅提高提取物中的靈芝多糖的含量及得率，與直接提取相比，多糖含量提高114%，多糖得率提高104%。

表1 不同預處理方法對靈芝多糖提取效果的影響

2.2氣流精細粉碎預處理結合不同方法提取靈芝多糖由表2可知，氣流精細粉碎預處理結合堿提取獲得靈芝多糖的效果最佳，與表1的靈芝粗粉碎后直接提取相比，粗收率提高76%，多糖含量提高78%，多糖得率提高215%。氣流精細粉碎預處理結合醇提取、超聲結合酶提取及微波提取，相對于結合傳統的熱水提取方法，提取靈芝多糖的效果沒有明顯提高，并且超聲波結合酶提取甚至導致多糖含量及多糖得率的下降，也可能是處理條件未達到最優效果所致。熱水提取方法對設備要求不高，條件容易掌握，生產應用普及率高，無有機溶劑回收、產品中殘留及對環境的污染等問題，超微粉碎預處理結合傳統熱水提取方法即能大幅提高靈芝多糖的提取效果，故具有較強的生產實踐意義。

2.3靈芝多糖液相色譜檢測由圖1可知，氣流精細粉碎預處理后熱水提取的多糖物質峰型特征（b）與直接提取的（a）比較接近，出峰時間、各峰面積之間的比例都比較相似，總體峰面積為b＞a。推測氣流精細粉碎預處理后熱水提取跟直接提取相比，在提取靈芝多糖的效果方面，主要是在不明顯改變提取所得多糖的種類及互相之間比例的前提下，提高提取物中靈芝多糖的總體含量，從而使靈芝多糖得率提高，使提取更加充分完全。而氣流精細粉碎預處理結合堿提取的多糖特征圖譜（c），與直接提取相比變化較大，出峰的峰型明顯改變，提示提取所得靈芝多糖的性質發生了改變。

表2 氣流精細粉碎預處理結合不同方法提取靈芝多糖

圖1 不同靈芝提取物樣品的多糖液相特征圖譜

3 結論與討論

（1）對比浸泡、微波、氣流精細粉碎等預處理方式對從靈芝子實體中提取靈芝多糖效果的影響，其中氣流精細粉碎預處理能大幅提高靈芝多糖的提取效果，對比靈芝直接提取，粗收率變化較小，而多糖含量提高114%，多糖得率提高104%。

（2）考察氣流精細粉碎預處理結合熱水提取、醇提取、堿提取、超聲波結合酶提取、微波提取等提取方式在靈芝多糖提取方面的效果，最佳的組合方式為氣流精細粉碎預處理結合堿提取，可使粗收率提高76%，多糖含量提高78%，最終多糖得率提高215%。

（3）通過對不同處理方法所得靈芝提取物的多糖特征圖譜進行比較分析，認為氣流精細粉碎預處理對靈芝多糖提取效果的影響，主要是提高提取物中靈芝多糖的總體含量，從而使多糖得率提高，使提取更加充分，而對所提取多糖的種類及互相之間的比例影響不大。

（4）氣流精細粉碎預處理能大幅提高靈芝多糖的提取效果，且對所提取多糖性質的影響較小，推測氣流粉碎預處理主要是破環了靈芝精粉的機械支撐壁膜結構，使細胞內功效物質的溶出更加完全，這方面內容將在后續實驗開展中進行研究分析。