不同添加物對金針菇幾種胞外酶活性的影響

宋 琪 王爍翔 于魯萌

（煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005）

金針菇Flammulina velutipes又名金菇、構菌、樸蕈等。金針菇子實體由細長而脆嫩的菌柄和形似銅錢的菌蓋組成，呈乳白色或金黃色，蓋滑，柄脆，是世界上產量最高的食用菌之一。金針菇具有食療保健的藥用價值。有關金針菇的遺傳育種[1]、同工酶[2]、生物活性物質開發[3]、栽培技術[4]及液體培養[5]等研究已有報道，而在其固體培養條件下的特性及胞外酶活性的研究則報道較少。金針菇的主要栽培基質有木屑、棉子殼、廢棉渣、玉米芯，麥草、稻草秸稈等。為促進主料的栽培利用，通常添加不同輔料改變主料的碳氮比和微量元素的含量，以適應不同食用菌對主料營養的利用[6]。研究是以棉子殼為主要栽培基質輔以不同添加物探討了金針菇在固體培養基上培養時的特性及其胞外酶的活性變化，確定不同添加物對各種胞外酶分解棉子殼中各種營養物質影響的差異，在實際應用中對進一步提高栽培技術有一定的意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料金針菇江都18，購自江蘇天達食用菌研究所。羧甲基纖維素鈉、木聚糖、果膠和半乳糖醛酸為Sigma公司產品，定性濾紙為杭州宮陽特種紙廠生產，其它藥品多為國產分析純。培養基a：棉子殼100%；培養基b：棉子殼90%，淀粉10%；培養基c：棉子殼 98.6%，石膏1%，K2HPO4、KH2PO4各0.2%；培養基d：棉子殼99.8%，尿素0.2%。

1.2栽培方法采用瓶栽方法，按上述培養基配方配比，每瓶折合干料重90 g。根據配方按料水比1∶1.4將培養基拌勻后，裝入500 mL罐頭瓶。滅菌、接種、栽培管理等方法按常規方法[7]。

1.3測定方法

1.3.1 酶活測定 在金針菇生長的不同階段：①接種后10 d；②接種后16 d；③接種后22 d；④接種后28 d；⑤原基期；⑥幼菇期；⑦開傘期；⑧采收后第6天，取每種培養基各三瓶，將培養基倒出后充分混勻，取20 g加100 mL純凈水20℃浸提4 h，八層紗布過濾后，1400×g離心10 min，上清液即為粗酶液，另外每種培養基各取20 g在80℃恒溫箱中烘至恒重。

羥甲基纖維素酶（CMC）、濾紙纖維素酶（FP）參照文獻[8]的方法；淀粉酶、果膠酶參照文獻[9]的方法；β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶（HC）、漆酶和過氧化物酶分別參考文獻[10-13]的方法。每個處理重復3次。

1.3.2 菌絲生長速度 菌絲生長至瓶肩處開始劃線，每五天劃一次，用十字劃線法計算其生長速度。

1.3.3 組分分析計算方法 培養基失重和呼吸消耗參照文獻[14]的方法。絕對生物學效率（%）=子實體干重（g）/培養基干重（g）×100。

2 結果與分析

2.1棉子殼培養基中不同添加物對金針菇三種生物學性狀的影響

2.1.1 對金針菇菌絲生長速度的影響 由表1可知在不同培養基中，金針菇從接種到菌絲長滿瓶所需要的天數分別為33、31、32、32 d，添加了淀粉的培養基b菌絲生長速度最快，添加了尿素和石膏的c、d培養基菌絲長勢次之，沒有添加物的培養基a菌絲生長的最慢。說明這些添加物能夠促進金針菇菌絲的生長。

2.1.2 絕對生物學效率與呼吸消耗的影響 金針菇在四種培養基中生長40～50 d，可以長出子實體并獲得第一潮菇，據此可得第一潮菇的絕對生物學效率。在培養基a上生長時培養基失重19.20%，其中5.02%轉化為子實體生物量；在培養基b上生長時培養基失重19.09%，其中4.37%轉化為子實體生物量。在培養基c上生長時培養基失重24.22%，其中6.31%轉化為子實體生物量。在培養基d上生長時培養基失重20.11%，其中4.58%轉化為子實體生物量。添加尿素的培養基c的金針菇絕對生物學效率最高，為6.31%，高于沒有添加物的培養基a。添加淀粉的培養基b和添加石膏及礦質元素的培養基d的金針菇絕對生物學效率沒有多大差異，分別為4.37%和4.58%，明顯比培養基a要低。

表1 不同培養基對金針菇絕對生物學效率與呼吸消耗的影響

2.2棉子殼培養基中不同添加物對金針菇八種胞外酶活性的影響

2.2.1 不同添加物對CMC酶活性的影響 由圖1可知在菌絲營養生長階段（第10～22天），添加淀粉的培養基b、添加尿素的培養基c、添加石膏的培養基d都能提高CMC酶在棉子殼培養基中的酶活性，但在菌絲生長第22天一直到栽培結束，這三種添加物對酶活性大小的影響無明顯差異，且變化趨勢具有較好的一致性。只有添加尿素的培養基d在菌絲生長22 d后，CMC酶高些。在整個栽培過程中，四種培養基中的CMC酶的平均酶活性在子實體生長發育階段，高于菌絲營養生長階段。

圖1 不同添加物對CMC酶活性的影響

2.2.2 不同添加物對HC酶活性的影響 由圖2可知，不同添加物對HC酶在整個栽培過程中的變化趨勢影響不大，但對酶活性大小有一定的影響。在四種培養基中，均是子實體生長發育階段平均酶活性高于菌絲營養生長期。不同添加物只是影響了HC酶在子實體生長發育階段酶活性峰值出現的先后順序和平均酶活性大小。加入淀粉的培養基b，所測得的HC酶活性高峰在原基期；加入尿素的培養基c，HC酶活性峰值出現在幼菇期，其原基期以后一直到栽培就結束，酶活性都高于沒有添加物的培養基a；加入石膏的培養基d，在原基期和開傘期出現兩個酶活性峰值，且從接種后28 d，一直到栽培結束，HC酶活性明顯高于沒有添加物的培養基a。

圖2 不同添加物對HC酶活性的影響

2.2.3 不同添加物對FP酶活性的影響 由圖3可知，在整個栽培過程中，同一時期的FP酶在四種培養基中的酶活性大小，差異不明顯，尤其是在菌絲生長16 d后，一直到栽培結束，酶活性大小差異并不明顯。只有在菌絲生長初期（10 d左右），相比較只有棉子殼的培養基a，添加淀粉和尿素培養基，提高了FP酶的活性。總體來說，雖然不同添加物，在一定程度上影響了不同階段FP酶活性大小，但并不影響酶活性的大致變化趨勢。

2.2.4 不同添加物對β-葡萄糖苷酶活性的影響 由圖4可知，β-葡萄糖苷酶在四種培養基中的酶活性變化趨勢大致相同。從接種后10 d到栽培結束，β-葡萄糖苷酶變化差異不大，子實體生長發育階段，平均酶活性稍高于菌絲生長期。只有在菌絲生長前期（10 d左右），添加淀粉和尿素提高了β-葡萄糖苷酶在棉子殼培養基中的酶活性，在菌絲生長28 d一直到子實體成熟期添加了淀粉的培養基b和添加了石膏的培養基d中，β-葡萄糖苷酶活性都低于沒有添加物的培養基a。

2.2.5 不同添加物對果膠酶活性的影響 由圖5可知，在金針菇菌絲營養生長前期（第10～22天）果膠酶活性較高。添加石膏或淀粉能提高果膠酶在此階段的活性，但加入尿素反而使果膠酶在此階段的活性偏低，但在菌絲營養生長后期（第22天）一直到栽培結束，果膠酶在四種培養基中的活性變化趨勢一致性比較好，同一栽培時期不同培養基的酶活性大小無明顯差異，同一種培養基在這段時間內果膠酶活性大小更無明顯差異。

2.2.6 不同添加物對淀粉酶活性的影響 由圖6可知淀粉酶在四種培養基中的活性變化趨勢大致相同，即菌絲營養生長階段活性相對較高，子實體生長發育階段活性較低。總體上隨著栽培時間的延長，淀粉酶活性逐漸下降，而且較為明顯地是加入淀粉、尿素或石膏能提高淀粉酶在整個栽培階段的酶活性，尤其是添加淀粉可顯著提高淀粉酶的活性。

圖3 不同添加物對FP酶活性的影響

圖4 不同添加物對β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖5 不同添加物對果膠酶活性的影響

圖6 不同添加物對淀粉酶活性的影響

2.2.7 不同添加物對過氧化物酶活性的影響 由圖7可知過氧化物酶在四種培養基中的活性變化呈時升時降的趨勢，但在整個栽培階段平均酶活性呈下降趨勢，由培養基a和b的變化趨勢可以看出，添加淀粉對過氧化物酶活性大小和變化趨勢影響最小，添加石膏的培養基d中，過氧化物酶活性在整個栽培階段低于沒有添加物的培養基a。由圖7還可以看出，從原基期到開傘期過氧化物酶活性最低，有時酶活性降為0。

2.2.8 不同添加物對漆酶活性的影響 由圖8可知，金針菇菌絲營養生長階段添加石膏的培養基d漆酶活性最低。不同培養基的漆酶活性都有高峰出現。培養基a和培養基d在原基期達到活性高峰。添加尿素使得培養基c在菌絲生長22 d達漆酶活性高峰。添加淀粉的培養基d漆酶活性在整個過程中呈遞降趨勢。在菌絲生長10 d和28 d酶活性較高。在子實體成熟期四種培養基中漆酶活性同時降到最低值，接近為0。子實體采摘后漆酶活性又開始上升。但總體來說不同添加物對漆酶活性變化趨勢沒多大影響。只是不同程度上影響到漆酶活性大小及酶活性高峰出現的早晚。

圖7 不同添加物對過氧化物酶活性的影響

圖8 不同添加物對漆酶活性的影響

3討論

向棉子殼中添加淀粉、石膏，不能提高金針菇的絕對生物學效率，而向棉子殼中添加一定量的尿素，既能促進金針菇菌絲生長，也能提高絕對生物學效率。這可能與氮素有利于菌絲體細胞中蛋白質、核酸、酶和輔酶等生物大分子合成，加速細胞的代謝水平，促進菌絲體對生物大分子的分解、吸收、利用和轉化有關。據此可推測，在生產實踐中，當以棉子殼為主料栽培金針菇時，可添加尿素以達增產目的。

金針菇具有完整的纖維素酶系，金針菇在四種培養基上生長期間，培養基中始終存在CMC酶、FP酶和β-葡萄糖苷酶活性，這不同于人們對玉覃[15]和銀耳[16]等的研究，而與靈芝[17]相似，這說明金針菇胞外纖維素酶系完整。這為金針菇分解纖維素奠定了生理基礎。金針菇的胞外CMC酶、FP酶、β-葡萄糖苷酶在子實體生長發育階段具有相對較高的酶活性，這種現象與人們對雙孢蘑菇[18，19]、香菇[20，21]、四孢蘑菇[22]等的一些研究相似。對此的解釋是：金針菇原基形成后，隨著菌絲細胞內儲藏的糖原、海藻糖[23]和菌絲體蛋白[24]等的消耗，內源性營養物質已不能滿足子實體迅速生長發育的需要。纖維素酶活性的增加可加速其對培養基中纖維素降解，滿足子實體迅速生長發育對物質和能量的需求。漆酶和過氧化物酶活性均隨栽培時間的延長逐漸下降，這與金頂側耳、巴西蘑菇等食用菌的情況相似[25，26]。這表明木質素的降解可能隨食用菌栽培時間的延長逐漸減少。

金針菇的胞外淀粉酶和果膠酶都是在菌絲生長階段活性較高，子實體發育期活性較低，據此可推測，淀粉和果膠在菌絲生長期的降解量可能大于子實體的生長發育期，這些胞外酶主要在菌絲生長階段發揮作用，對子實體的形成與發育影響不大。

由圖1～8可知，不同添加物所形成的不同營養環境對金針菇胞外酶活性大小影響較大，對酶活性的變化趨勢影響較小，這一結論與人們對香菇[27]胞外酶活性的研究結果相似。這表明，在能夠長子實體的培養基中，菌絲體所處的營養環境對酶的活性大小影響較大，而對酶的活性變化趨勢影響較小。