電針對不同月齡APP/PS1轉基因小鼠行為學的影響

王鑫,許安萍,曹瑾,盧夢晗,呂威,景泉凱,高揚,高譽姍,薛衛國,李志剛

?

電針對不同月齡APP/PS1轉基因小鼠行為學的影響

王鑫,許安萍,曹瑾,盧夢晗,呂威,景泉凱,高揚,高譽姍,薛衛國,李志剛

(北京中醫藥大學,北京 100029)

目的 研究電針對不同月齡APP/PS1轉基因小鼠行為學的影響,探討電針治療阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)的最佳干預時間。方法 選擇4、6、9月齡APP/PS1雙轉基因小鼠各20只,隨機分為模型組、電針組,以相同月齡C57BL/6野生鼠各10只作為對照組;電針治療6星期后,采用Morris水迷宮進行空間記憶行為學測試,觀察各月齡各組行為學的變化。結果 5月齡各組組間比較差異均無統計學意義(＞0.05),時間因素(day)具有統計學意義(＜0.01);7月齡各組組間、時間因素及交互作用比較均具有顯著性差異 (＜0.01);10月齡各組組間、時間因素、交互作用比較差異均有統計學意義(＜0.05)。各月齡各組空間探索實驗穿越平臺次數及平臺象限游泳距離比較,差異有統計學意義(＜0.05)。結論 電針可以改善APP/PS1雙轉基因鼠的學習記憶能力,6～7月齡可能是電針早期干預AD的最佳治療接入點,但仍需進一步實驗機制研究討論。

電針;阿爾茨海默病;行為學測試;Morris水迷宮;APP/PS1轉基因小鼠

阿爾茲海默病(Alzheimer's disease, AD)又稱老年性癡呆,是老年人常見的一種慢性進行性神經系統退行性疾病,伴有認知記憶能力損傷、智力減退和行為人格退化[1]。AD作為不可逆轉的記憶損傷性病變,目前還沒有一種有效的治療方法,臨床上針灸對AD患者的認知功能有一定改善,因此針灸對AD的作用機制值得深入研究。

Morris(morris water maze, MWM)水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計,主要用于研究大鼠空間學習記憶能力[2],是判斷實驗動物學習記憶能力的重要儀器之一。因其操作簡單、使用方便,目前廣泛應用于藥物劑量篩選、療效初步評價等實驗研究中[3-5]。Morris水迷宮實驗是一種強迫實驗動物(大鼠、小鼠)游泳,使其學習尋找隱藏在水中平臺的一種實驗,主要用于測試實驗動物對空間位置覺和方向覺(空間定位)的學習記憶能力。

近10年報道均證明APP/PS1雙轉基因小鼠在6個月已經出現認知障礙[6-8],而針刺能改善AD模型小鼠的學習記憶能力[9-10],本課題組對4、6、9月齡APP/PS1雙轉基因小鼠進行電針治療后用Morris水迷宮進行行為學檢測,本文主要對比電針干預不同月齡AD模型的差異,以尋求針刺治療AD的最佳時機,為臨床治療做出指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

以4、6、9月齡APP/PS1雙轉基因雄性小鼠為AD動物模型,以同背景同月齡同性別的C57BL/6野生鼠為正常對照組。動物購自南京大學模式動物研究所[(動物批號SCXK(寧)2010-000)],清潔級,于北京中醫藥大學動物中心屏障系統單籠飼養,溫度(25±2)℃,濕度(50±20)%,自然光照,自由進食、進水。本實驗經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 動物分組及處理

選擇各個月齡APP/PS1雙轉基因鼠20只,隨機分為模型組10只,電針組10只,以同背景野生鼠C57BL/6野生鼠10只為對照組。

電針組電針百會及雙側涌泉,平刺2～3 mm。電針正負極分別接左右側涌泉,采用疏密波,頻率1/50 Hz,強度0.3 mA,以針柄震顫,動物保持安靜不掙扎嘶叫為度。每次電針持續15 min。

對照組、模型組以相同方法用鼠袋束縛15 min。

3組均隔日1次,連續治療6星期。

1.3 主要儀器

韓氏穴位神經刺激儀(北京華衛產業開發公司, HANs LH202H型);0.25 mm×13 mm中研太和一次性使用無菌針灸針;Morris水迷宮(北京中醫藥大學附屬東直門中醫院中藥藥理學實驗室提供);BS-124S Morris水迷宮視頻分析系統(上海移動信息科技有限公司生產)。

1.4 實驗方法

采用Morris水迷宮進行學習記憶行為學檢測。電針干預6星期后的第2～6天進行水迷宮訓練,水溫(22±2)℃,按邊緣及方向等距離將水池依次分為4個象限。水池第三象限內放有圓形站臺,實驗前將水桶灌以清水至預定高度(水面高出平臺1 cm)。實驗前1 d將各組小鼠置于站臺上10 s適應環境。之后實驗第1 d到第4天,各組小鼠予定位航行實驗,先將小鼠置于站臺上適應10 s,隨后依次4個象限將小鼠面壁放入水中,分別記錄動物在水中逃避潛伏期,小鼠登上平臺5 s后終止記錄時間,最長記錄時間為60 s。第5天行空間探索實驗,撤除平臺,直接將小鼠按象限依次放入。以定位航行實驗第四象限為入水點的逃避潛伏期、空間探索實驗穿越平臺位置次數及平臺象限游泳路程為評判小鼠學習記憶能力的指標。

1.5 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS20.0統計軟件分析。計量數據采用均數±標準差表示。逃避潛伏期采用重復測量數據的方差分析,空間探索實驗中組間比較采用單因素方差分析。以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮定位航行實驗

2.1.1 5月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較

5月齡重復測量方差分析顯示組間(group)比較無統計學差異(＞0.05),時間因素(day)有統計學意義(＜0.01),說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢。

第3天對照組和模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.05);電針組和模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.05)。對照組在第2天開始,與第1天比較有顯著統計學差異(＜0.01);模型組在第3天開始與

第1天比較有顯著統計學差異(＜0.01);電針組在第3天開始與第1天比較出現統計學差異(＜0.05);各組第4天與第1天比較有顯著統計學差異(＜0.01)。詳見表1。

表1 5月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表1 5月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

組別n第1天第2天第3天第4天 對照組1059.40±1.8844.63±11.892)39.21±16.822)3)43.16±7.882) 模型組1059.32±2.1247.00±14.0942.38±10.742)48.22±10.482) 電針組1058.49±3.8358.95±3.3052.17±8.691)3)41.43±16.662)

注 :與同組第1天比較1)＜0.05,2)＜0.01;與模型組比較3)＜0.05

4 d的逃避潛伏期的趨勢圖顯示,3組逃避潛伏期隨訓練天數都有所下降,第4天模型組和對照組稍有回增。詳見圖1。

7月齡重復測量方差分析顯示組間(group)比較差異有統計學意義(＜0.01),時間因素(day)有統計學意義(＜0.01),說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢;時間和分組的交互作用(day×group)有統計學意義(＜0.01),說明時間因素的作用隨著分組的不同而不同。

隨著訓練天數增加,逃避潛伏期都有所縮短;第2天和第4天對照組和模型組比較具有顯著統計學差異(＜0.01);電針組和模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.05)。對照組第4天與第1天比較有顯著統計學差異(＜0.01)。詳見表2。

表2 7月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表2 7月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

組別n第1天第2天第3天第4天 對照組1054.32±6.0647.40±10.223)42.21±17.6832.45±12.821)3) 模型組1055.30±2.2160.00±0.0053.64±11.1957.76±7.06 電針組1055.36±7.8856.17±5.632)47.09±11.9346.99±12.032)

注 :與同組第1天比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

4 d天數都有所下降,第4天模型組和電針組稍有回增。詳見圖2。

圖2 7月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

2.1.3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較

10月齡重復測量方差分析顯示組間(group)比較差異有統計學意義(＜0.05),時間因素(day)有統計學意義(＜0.01),說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢;時間和分組的交互作用(day×group)有統計學意義(＜0.05),說明時間因素的作用隨著分組的不同而不同。

隨著訓練天數增加,逃避潛伏期都有所縮短;第3天和第4天對照組和模型組比較差異有統計學意義 (＜0.01,＜0.05);電針組和模型組比較有統計學差異(＜0.05)。對照組、電針組第4天逃避潛伏期與第1天比較有顯著的統計學差異(＜0.01)。詳見表3。

表3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

組別n第1天第2天第3天第4天 對照組1057.37±6.8648.21±14.7841.44±15.231)3)43.44±12.531)2) 模型組1059.77±0.8457.61±5.2456.27±10.4355.40±6.74 電針組1057.46±5.5555.74±7.5442.07±17.262)41.24±12.891)2)

注 :與同組第1天比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

4 d的逃避潛伏期的趨勢圖顯示,3組逃避潛伏期隨訓練天數都有所下降,第4天對照組和電針組稍有回增。詳見圖3。

圖3 10月齡各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

2.1.4 不同月齡模型組逃避潛伏期比較

由圖4可見,5月齡模型組隨訓練時間增加,逃避潛伏期減少。相對于10月齡逃避潛伏期趨勢圖的波動,7月齡的逃避潛伏期趨勢圖相對平穩。

2.1.5 不同月齡電針組逃避潛伏期比較

由圖5可見,5月齡電針組的逃避潛伏期隨時間增加,逃避潛伏期減少,趨勢最明顯;7月齡的逃避潛伏期后2 d相對持平;10月齡隨著訓練時間增加,逃避潛伏期持續降低,但個體差異大。

圖4 不同月齡模型組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

圖5 不同月齡電針組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期

表4 各月齡各組空間探索實驗穿越平臺位置次數、平臺象限游泳路程比較 (±s,s)

表4 各月齡各組空間探索實驗穿越平臺位置次數、平臺象限游泳路程比較 (±s,s)

組別月齡n穿越平臺位置次數平臺象限游泳路程 對照組5月齡101.32±0.881)312.88±134.21 模型組100.55±0.45210.10±118.71 電針組101.22±1.011)284.65±146.39 對照組7月齡102.00±0.662)349.42±70.702) 模型組100.73±0.46205.05±67.14 電針組100.87±0.59216.26±77.96 對照組10月齡101.36±0.621)276.26±38.59 模型組100.60±0.41219.10±70.95 電針組101.07±0.621)267.93±87.60

注 :與模型組比較1)＜0.05,2)＜0.01

2.2 空間探索實驗

各月齡各組空間探索實驗穿越平臺次數及平臺象限游泳距離比較,差異有統計學意義(＜0.05)。各月齡模型組穿越平臺次數均明顯低于對照組(＜0.05,＜0.01)。7月齡模型組平臺象限游泳路程低于對照組(＜0.01)。5月齡和10月齡電針組穿越平臺次數高于模型組(＜0.05)。詳見表4。

3 討論

Morris水迷宮行為學測試定位航行與空間搜索實驗成績分別反映動物的學習記憶能力和記憶保持能力[11]。在AD的臨床治療上,針刺可以起到改善患者記憶和學習能力的效果,但在AD發病過程中,針灸治療最佳的治療介入時間,是在AD的發病前,還是早期,是本研究最主要的研究目的。

中醫學認為AD病機是“腎虛、痰濁阻絡”,本課題組采用電針百會、涌泉配穴干預AD模型發病。該配穴處方來源于古代醫籍,《標幽賦》記載:“天地人三才也,涌泉同璇璣、百會。”一天一地,一上一下,百會、涌泉穴能溝通上下之經氣,開通人體上下兩部,可益智開竅,疏通經脈,從而達到改善AD學習記憶功能的效果。

7月齡前可能是AD模型出現學習功能障礙早期。5月齡重復測量方差分析說明時間和分組之間不存在交互作用,且組間差異不隨時間變化而變化,模型組隨著學習時間的增長,逃避潛伏期與第1天有明顯的差異,說明模型組大鼠也學會了空間探索尋找平臺的能力,只是空間記憶能力下降,說明5月齡的APP/PS1小鼠并沒有喪失空間學習記憶能力,電針組和模型組沒有明顯的差異(＞0.05);7月齡,模型組和電針組第2、3、4天逃避潛伏期與第1天比較無明顯差異,模型組和電針組沒有學會空間認知,空間記憶能力喪失,而早期電針治療已有明顯的效果,電針組和模型組的逃避潛伏期比較差異有統計學意義(＜0.05);10月齡,模型組同樣沒有學會空間認知,空間記憶能力喪失,電針組逃避潛伏期較模型組也有明顯縮短(＜0.05)。綜上,電針可以改善AD模型的學習記憶能力。

電針可以改善AD模型的空間探索能力,各月齡模型組穿越平臺次數均明顯低于對照組(＜0.05,＜0.01)。7月齡模型組平臺象限游泳路程低于對照組(＜0.01)。5月齡和10月齡電針組穿越平臺次數高于模型組(＜0.05)。

6～7月齡可能是針灸早期干預的最佳時期。老年斑是AD發病過程中的主要病理,其主要成分是Ab,本課題組前期研究證明,針刺對5月齡的Ab水平有下降的趨勢,但無明顯差異[12];7月齡時Ab40、42水平都急劇增多,模型組較對照組差異明顯,而針灸組治療后也較模型組有明顯的降低[13];本課題組Elisa檢測10月齡Ab含量,稀釋3600倍結果仍超出范圍;Ab有可溶性和不可溶性之分[14],針灸治療主要作用于可溶性Ab的代謝,在10月齡的AD模型內已存在大量的老年斑斑塊[15],根據水迷宮結果顯示,各月齡模型組和電針組的空間學習記憶能力有所下降;5月齡模型組和電針組隨訓練時間增加,逃避潛伏期減少;7月齡模型組的逃避潛伏期變化相對平穩,電針組干預后,逃避潛伏期縮短;10月齡模型組逃避潛伏期趨勢圖的波動,說明模型組空間探索能力受到損害,電針組逃避潛伏期持續降低,但個體差異大。

AD發病機制復雜,不僅有老年斑的沉積、tau蛋白纏結、小膠質細胞活化、神經元丟失,學習記憶能力的減退與病理相聯系[16],本實驗結果顯示,電針可以改善AD模型小鼠的學習記憶能力,但相關機制還需要進一步的研究,未來可以擴大樣本量,并與病理指標做相關性分析,找出電針干預AD的最佳時機的機制,指導臨床AD的治療。

[1] 趙鵬,孫亞平,陳紅,等.阿爾茨海默病發病機制探究[J].中風與神經疾病雜志,2016,33(1):86-89.

[2] Morris RGM. Spatial localization does not require the Presence of local cues[J].&, 1981, 12(2):239-260.

[3] 武海霞,吳志剛,劉紅彬,等.Morris水迷宮實驗在空間學習記憶研究中的應用[J].神經藥理學報,2014,4 (5):30-35.

[4] 羅小泉,駱利平,陳海芳,等.Morris水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討[J].時珍國醫國藥,2010,21(10): 2667-2669.

[5] 劉金鳳,聶坤,栗振杰,等.Morris水迷宮測評方法的改進及對快速老化癡呆小鼠SAMP8認知功能的再評價[J].中國中醫急癥,2013,22(1):5-7.

[6] Stover KR, Brown RE. Age-related changes in visualacuity, learning and memory in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease[J]., 2012,231(1):75-85.

[7] O’Leary TP, Brown RE. Visuo-spatial learning and mem- ory deficits on the Barnes maze in the 16-month-old APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease[J]., 2009,201(1):120-127.

[8] Garcia-Alloza M, Robbins EM, Zhang-Nunes SX,. Characterization of amyloid deposition in the APPswe/ PS1dE9 mouse model of Alzheimer disease[J]., 2006,24(3):516-524.

[9] 姜婧,高凱,周源,等.Micro-PET與Morris水迷宮觀察“通督啟神”針法對AD模型小鼠療效的影響[J].中華中醫藥雜志,2015,30(5):1670-1674.

[10] 白楊,薛衛國,高亮,等.電針對APP/PS1轉基因AD鼠Morris水迷宮學習記憶及腦皮層Ab水平的影響[J].針灸臨床雜志,2014,30(8):74-77.

[11] Bromley-Brits K, Deng Y, Song W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice[J]., 2011,(53)pii:2920.

[12] 李芙,李麗娜,王鑫,等.電針“百會”“涌泉”對APP/PS 1雙轉基因小鼠海馬b淀粉樣蛋白及低密度脂蛋白受體相關蛋白-1水平的影響[J].針刺研究,2015, 40(1):30-34.

[13] 王鑫,加吾拉·阿不力孜,李芙,等.電針對APP/PS1雙轉基因小鼠行為學及皮層Ab1-42、LRP1表達的影響[J].中華中醫藥雜志,2015,30(5):1513-1518.

[14] Jin M, Shepardson N, Yang T,. Soluble amyloidb- protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration[J]., 2011,108 (14):5819-5824.

[15] 加吾拉·阿不力孜,王鑫,李芙,等.觀察電針“百會”、“涌泉”兩穴對不同月齡APP/PS1雙轉基因小鼠海馬 Ab淀粉樣沉淀及超微結構的影響[J].環球中醫藥, 2015,8(5):518-522.

[16] Evin G. Future Therapeutics in Alzheimer’s Disease: Development Status of BACE Inhibitors[J]., 2016,30(3):173-94.

Effect of Electroacupuncture on the Behavior of APP/PS1 Transgenic Mice of Different Age

,-,,-,,-,,-,-,-.

,100029,

Objective To study the effect of electroacupuncture on the behavior of APP/PS1 transgenic mice of different age, and to explore the optimal intervention time of electroacupuncture in treating Alzheimer’s disease (AD). Method APP/PS1 double-transgenic mice of 4 months, 6 months and 9 months old, 20 in each age group, were randomized into a model group and an electroacupuncture group, and ten C57BL/6 wild-type mice were taken as a control group; after 6-week electroacupuncture treatment, the Morris water maze was adopted for spatial memory and behavioral test, and the changes of behavior in each group were observed. Result Of the 5-month-old mice, there were no significant between-group differences (＞0.05), while the time factor (day) produced a statistical significance (＜0.01); of the 7-month-old mice, there were significant differences considering the different groups, time factor and interaction (＜0.01); of the 10-month-old mice, there were significant differences considering the different groups, time factor and interaction (＜0.05). The spatial probe test showed that there were significant between-group differences in comparing the platform crossings and swimming distance in platform quadrant in each age group (＜0.05). Conclusion Electroacupuncture can improve the learning and memory of APP/PS1 double-transgenic mice, the age of 6-7 months old is possibly the optimal intervention time of electroacupuncture for AD, but there still requires further mechanism studies.

Electroacupuncture; Alzheimer disease; Behavior rating scale; Morris water maze; APP/PS1 transgenic mice

1005-0957(2017)05-0614-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.05.0614

國家自然科學基金項目(81273826,81273825)

王鑫(1988—),女,博士生,Email:xinflare827@126.com

李志剛(1965—),男,教授,Email:lizhigang620@126.com 薛衛國(1968—),男,教授,Email:snowmanxue@163.com

2016-11-03