丙戊酸對HL—60/HT細胞P27Kip1、P170表達水平的影響

胡建鋒+尹松梅+謝雙鋒

[摘要] 目的 了解丙戊酸對HL-60/HT細胞P27Kip1的影響。方法 建立白血病耐藥細胞株HL-60/HT，MTT法檢查丙戊酸作用前后細胞增殖情況及對Ara-c耐藥性的改變，流式細胞儀檢測HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1、P170的表達。結果VPA能增加HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），而不影響P170的表達（P>0.05）；Ara-c不能影響HL-60、HL-60/HT細胞的P27Kip1、P170的表達（P>0.05）；VPA與Ara-C聯用能增加HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），不影響P170的表達（P>0.05）。結論 HL-60/HT細胞P27Kip1低于HL-60，丙戊酸能增加HL-60/HT細胞P27Kip1的表達。

[關鍵詞] 白血病；丙戊酸；HL-60/HT細胞；耐藥性

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）06-151-04

[Abstract] Objective To understand the impact of valproic acid to expression level of P27Kip1 and P170 of HL-60/HT cells. Methods Leukemia resistant cell line HL-60/HT was established. MIT method was used to deteccell proliferation before and after valproic acid and its changes to drug resistance of Ara-c. Flow cytometry was used to detect the expression of P27Kip1 and P170 of HL-60 and HL-60/HT cells. Results VPA could increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Ara-c could not affect the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. VPA combined with Ara-C can increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Conclusion P27Kip1 of HL-60/HT cells is lower than HL-60 cells. Valproic acid can the expression of P27Kip1 of HL-60/HT cells.

[Key words] Leukemia； Valproic aci； HL-60/HT cell； Drug resistance

近年白血病發病率有所上升，其治療方法多采用聯合化療[1]，60%～70%患者經治療后癥狀緩解后復發。白血病細胞固有或獲得的多藥耐藥性是在治療過程中出現失敗的重要原因[2-5]。多耐藥基因mdr-1表達產物P170起著重要作用。P27Kip1能調控mdr-1基因的轉錄，減少P170表達，逆轉多耐藥細胞的耐藥性[6-7]。丙戊酸（VPA）是常用的抗癲癇藥物，治療癲癇具有很好的效果，是一種組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑，通過調節染色質構象和轉錄活性，進而影響基因表的的活性藥物。近來研究發現丙戊酸能降低HL-60/HT細胞對Ara-c的耐藥性[8]，而丙戊酸是否通過P27Kip1、P170途徑起作用呢？本研究進一步分析了丙戊酸對HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1、P170表達的影響。

1 材料與試劑

本研究所需試劑與材料有RPMI1640培養基、二甲基亞砜、四氮唑藍、VPA、淋巴細胞分離液、HEPES、羥乙基哌嗪乙磺酸、VCR、HT、Ara-C、HL-60細胞，均由正規公司及企業購買。

2 方法

2.1 正常人單個核細胞的分離

選擇10名健康的體檢者，取空腹血置肝素抗凝管，加入D-HankS液平鋪于液面上，混勻后離心約20min，離心后試管內分為3層，吸取單個核細胞層，置另一試管中，加入5倍以上容量的D-HankS液，洗滌細胞，最后一次離心后去上清液，然后加入PBS緩沖液，重懸細胞后留用。

2.2 細胞培養及建立耐藥株

將HL-60細胞接種于RPMI-1640完全培養基上，37℃、5%CO2培養增菌，換液1次/2d，4～5d傳代一次。

采用極限稀釋法篩選耐藥的細胞克隆。具體方法為：將對數期HL-60細胞培養于RPMI 1640培養基中，建立HL-60/HT耐藥細胞株。HT濃度為0.005μg/mL，2d后換培養液，清洗，去除藥物，繼續培養2d。經3次初始濃度的培養后，藥物濃度增為原來的2倍。5個月后測定HL-60/HT耐藥細胞的半數抑制濃度（IC50），對多藥耐藥細胞進行確認。

2.3 藥物對兩種細胞的增殖抑制率

通過MTT法檢測Ara-c抑制HL-60/HT、HL-60細胞的增殖情況。取重懸的細胞接種于96孔平板，每孔200μL，約20 000個細胞，5%CO2、37℃條件下孵育24h，然后加入Ara-C。兩組均有無培養液和無藥對照組。48h后每孔加入20μL濃度為5g/L MTT，繼續孵育4h后除去培養液，每孔加150μL DMSO，置震蕩儀上振蕩10min，采用酶標儀，以無細胞組調零，測595nm和492nm處的吸光度。細胞生長抑制率=（無藥對照組吸光度均值-實驗組吸光度均值）/無藥對照組吸光度均值×100%[9]。計算各種藥物的IC50。

2.4 耐藥的穩定性測定

用無藥RPMI 1640培養基培養HL-60/HT子代細胞兩個月，并檢測對HT的IC50值，具體方法參照2.3，確定HL-60/HT細胞耐藥穩定性。

2.5 流式細胞術測定P27Kip1、P170的表達

設HL-60和HL-60/HT細胞組，又各分正常人單個核細胞組、藥物（Ara-c、VPA單獨或聯合）作用前和作用后。將重懸細胞的密度調整為l×l06/mL，取100μL破膜液A加入到50μL細胞懸液中，并放置于避光的溫室內，用2mL PBS緩沖液以1000×g轉速離心5min洗滌，棄上清，于細胞懸液中加入破膜液B 100μL和5μL抗P27Kip1也可以是P170抗體，PBS緩沖液洗滌。加入FITC標記二抗5μL，靜置15min后離心洗滌。取1%濃度的多聚甲醛450μL，固定30min，然后用流式細胞儀進行檢測。將P27Kip1或P170抗體換成PBS即可進行空白對照。

2.6 統計學分析

所有數據均用SPSS12.0統計軟件處理，計量數據的描述用（）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 Ara-c對HL-60、HL-60/HT細胞的IC50

Ara-C對HL-60細胞的中位抑制濃度是0.20μg/mL，對HL-60/HT細胞的中位抑制濃度是0.73μg/mL，耐藥倍數3.65倍。

3.2 HL-60細胞耐藥穩定性檢測

HL-60/HT耐藥株傳代后，用無藥的RPMI 1640培養基培養其子代細胞，測定其對HT的IC50，結果無明顯改變，細胞株的耐藥性能穩定。

3.3 細胞表達P27Kip1、P170水平

正常細胞、HL-60細胞及HL-60/HT細胞中P27Kip1表達水平依次降低，兩組間差異均有統計學意義（P<0.05）；HL-60/HT細胞的P170表達水平明顯高于正常細胞及HL-60細胞，差異均有統計學意義（P<0.05）。

3.4 VPA與Ara-c對不同細胞P27Kip1、P170表達水平的影響

HL-60細胞予1mmol/L VPA、0.2μg/mL Ara-c，HL-60/HT細胞予1mmol/L VPA、0.7μg/mL Ara-c各培養48h，流式細胞儀測定P27Kip1、P170的表達水平。結果提示VPA能增加HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），但對P170表達水平無顯著影響（P>0.05）；Ara-c對P27Kip1、P170的表達水平均無顯著影響（P>0.05），見表1。

3.5 比較VPA與Ara-c聯用對不同細胞的P27Kip1、P170表達水平影響

HL-60細胞用0.20μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培養48h，HL-60/HT細胞用0.70μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培養48h，流式細胞儀測定P27Kip1、P170的表達水平。結果顯示VPA與Ara-C聯用，能增加敏感HL-60細胞、耐藥HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），不影響P170的表達（P>0.05），見表2。進一步分析VPA、Ara-c在聯用用藥中各自對對HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的影響，結果提示無論在HL-60細胞還是HL-60/HT細胞，Ara-C對P27Kip1的表達水平無影響（均有P>0.05），VPA單用或聯用Ara-c均增加P27Kip1的表達水平（均P<0.05），見表3。

4 討論

白血病是血液病中較為常見的疾病，主要是由于造血干細胞異常克隆性疾病，近年來，隨著免疫學、細胞學、遺傳學、分子生物學的進步與發展，加強了對白血病患者的診斷，對白血病的本質有了更加深刻的認識。白血病患者的白細胞形態學具有特異性，可以依靠白細胞的形態學直接診斷，非典型白血病發病原因多樣，癥狀復雜，很難及時診斷。據相關文獻報道，白血病的漏診率為20%～36%，為此加強細胞學、免疫學、遺傳學、分子生物學具有重要的診斷意義。

本研究進一步分析VPA與P27Kip1、P170的關系，了解VPA發揮作用的可能機制。研究發現，隨著腫瘤惡性度增加，P27Kip1的表達逐漸減低[10-12]。本研究也發現在正常細胞、HL-60細胞、HL-60/HT細胞中，P27Kip1的表達逐漸減低，提示P27Kip1表達與細胞惡性程度、耐藥情況呈負相關[13-14]，可以監測P27Kip1的表達，判斷疾病惡性程度，了解耐藥細胞的產生，預測疾病預后。結果提示VPA對HL-60，HL-60/HT細胞的P170表達無影響，與其他研究的實驗結果一致[15]，可能和VPA與丁酸鈉、TSA的具體作用機制不同有關。VPA不增加白血病細胞P170的表達，相比于丁酸鈉、TSA更有希望成為應用于臨床的化療增敏劑。

耐藥白血病HL-60/HT、HL-60、P170細胞P27Kip 1的表達敏感度存在差異，敏感性最強的為P170，HL-60敏感性最弱，丙戊酸鈉可影響P27Kip 1的表達，增加G1期細胞含量，發揮抗腫瘤活性；同時，VPA可增強HL-60/HT細胞對Ara-C的敏感性，減輕其耐藥性，起到化療增敏的作用。丙戊酸鈉口服、攜帶方便，對正常細胞毒性低，具有抗腫瘤活性和增加化療敏感性的作用，可作為治療耐藥白血病輔助藥物。其作用機制尚不明確，有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 郭曉玲.復發/難治性急性髓系白血病的治療現狀及進展[J].臨床薈萃，2014，29（10）：1108-1113.

[2] 管曉翔，陳巍魏，陳龍邦，等. p27Kip1基因啟動子區的生物信息學分析[J].醫學研究生學報， 2010， 23 （10）：1029-1032.

[3] 王瑩，諸江，胡炯，等.丙戊酸鈉誘導髓系白血病細胞分化相關的分子標志物研究[J].診斷學理論與實踐，2011， 10（5）：434-439.

[4] 陳國強，趙倩，吳英理，等.白血病細胞分化與凋亡的化學生物學研究[J].上海交通大學學報（醫學版），2012，32（9）：1145-1154

[5] 黃勇，閆駿，馬敏.組蛋白去乙酰基酶在前列腺癌中的作用及機制研究[J].中國醫藥導報，2013，10（26）：13-15.

[6] 吳窈畫，談書華，范超超，等. MTT法檢測細菌細胞數的主要影響因素分析[J].微生物學雜志，2011，31（3）：67-72.

[7] 盧瑞南，盛瑞蘭，李建勇，等.急慢性白血病P27Kip1表達及其臨床意義[J].中國實驗血液學雜志，2004，12（3）：291-297.

[8] 陳惠瑜，林東紅，羅玲清，等.P27kip1與細胞周期蛋白G在急性白血病中的表達及相關性研究[J].中國實驗血液學雜志，2009，17（4）：847-851.

[9] 蔡宇.補骨脂素逆轉白血病HL60/HT耐藥細胞研究[J].中成藥，2004，26（9）：772-773.

[10] 陳志爐， 戴其舟， 王勇，等.紫草素對白血病細胞HL-60增殖及凋亡作用的影響[J].中國中西醫結合雜志，2012， 32（2）：239-243.

[11] 李益清，尹松梅，馮思瓊，等.丙戊酸誘導白血病HL-60細胞凋亡及其對h-tert基因表達的影響[J].中國實驗血液學雜志，2010，18（6）：1445-1450.

[12] 韓冬梅， 陳協群， 梁蓉，等.丙戊酸鈉抑制HL-60細胞增殖并誘導其凋亡與分化[J].中國實驗血液學雜志，2006，14（1）：21-24.

[13] 林東紅，韓燕燕，陳惠瑜，等.SU11248干預白血病細胞HL-60對P27KIP1和cyclin G蛋白表達的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2009，25（7）：628-630.

[14] 賈慶瑞.急性白血病細胞共表達p170和LRP的臨床意義[J].白血病·淋巴瘤，2002，11（5）：289-291.

[15] 何學鵬，楊科.急性白血病細胞表達多藥耐藥相關糖蛋白（p170）的臨床意義[J].白血病·淋巴瘤，1997，6（4）：244-247.

（收稿日期：2017-01-02）