甘薯發酵提取檸檬酸中黑曲霉發酵影響因素的研究

尹元金，羅 鉛

(北方民族大學 化工學院，寧夏 銀川 750021)

檸檬酸又名枸櫞酸，它是存在于檸檬等水果中的一種有機酸，學名為 3-羥基3-羧基戊二酸。檸檬酸具有令人愉快的酸味，它入口爽快，無后酸 味，安全無毒，是發酵法生產的最重要有機酸，廣泛應用于食品、化工、醫藥、日化、紡織、電子、建筑、鑄造等行業這[1]。檸檬酸為無色半透明晶體或白色顆粒或白色結晶性粉末，無臭、味極酸，易溶于水、乙醇、乙醚等[2]。天然檸檬酸在自然界中分布很廣，天然的檸檬酸主要存在于植物如檸檬、梅子、菠蘿等水果中；而現在所用的人工合成的檸檬酸主要是用一些含糖物質進行發酵而制得的。

1 檸檬酸發酵原料及其生產方法

1.1 檸檬酸發酵原料

糖類物質在自然界屬于可再生資源；而其資源也比較豐富。但在工業上選擇原料要從多個方面綜合考慮，例如：經濟合理、技術可行、資源豐富、易管、易購、易運、三廢等。

此次發酵原料—甘薯，屬于糖類。

1.2 檸檬酸發酵和提取方法

1.2.1 發酵

發酵方法有深層法、表面法、固體法、半固體法、生化反應器法。

微生物發酵檸檬酸是典型的好氧發酵。而現在最具優勢的發酵方法是黑曲霉菌種的深層發酵[3]，這種方法擁有較為可觀的檸檬酸產量。

1.2.2 提取

提取方法有鈣鹽離子交換法、溶劑萃取法、全離子交換法、連續離子交換法、色譜離子交換法、電溶析法、直接提取法[4]。我們此次所用的是鈣鹽離子交換法，它是當前世界上檸檬酸工業最廣泛采取的工藝，安全性高，但有石膏廢渣。

2 甘薯原料發酵實驗工藝

2.1 主要儀器及藥品

儀器：電子天平、發酵罐、立式滅菌鍋、恒溫水浴鍋、燒杯、試管、溫度計、精確pH試紙、堿式滴定管、布氏漏斗、抽濾機、干燥箱。

藥品：NaOH溶液、1mg/mL 葡萄糖標準液、酚酞、淀粉酶、瓊脂、葡萄糖、甘薯、硫酸銨溶液、無水乙醇、濃硫酸溶液、氯化鈣、無菌水、氨水。

2.2 實驗研究

2.2.1 初糖濃度對檸檬酸產酸的影響

在無菌干燥的情況下，取5個錐形瓶，將發酵液平均分配其中，并調整其發酵液初始糖濃度分別為 10%、14%、18%、20%，24%，按 10%的接種量接種黑曲霉菌種，在(35±1)℃的溫度下進行檸檬酸發酵，發酵48 h，每組試驗做三個平行試驗，然后分別測定發酵液產酸量求其平均值，得出最終的產酸量，從而確定該因素對檸檬酸發酵的影響。

2.2.2 溫度對檸檬酸發酵的影響

在無菌干燥的情況下，取6個錐形瓶，將發酵液平均分配其中，并調整發酵液初始糖濃度18%，按10%的接種量接種黑曲霉，分別在 30、33、35、37、40、42℃溫度下，進行檸檬酸發酵，發酵 48h，每組試驗做三個平行試驗，然后分別測定發酵液產酸量求其平均值，得出最終的產酸量，從而確定該因素對檸檬酸發酵的影響。

2.2.3 接種量對檸檬酸發酵的影響

在無菌干燥的情況下，取5個錐形瓶，將發酵液平均分配其中，并調整發酵液初始糖濃度 18%，分別按 6%，8%，10%，12%，14%的接種量接種黑曲霉，在(35±1)℃的溫度下進行檸檬酸發酵，發酵48 h，每組試驗做三個平行試驗，然后分別測定發酵液產酸量求其平均值，得出最終的產酸量，從而確定該因素對檸檬酸發酵的影響。

2.2.4 pH值對檸檬酸發酵的影響

在無菌干燥的情況下，取6個錐形瓶，將發酵液平均分配其中，并調整發酵液初始糖濃度 18%，按 10%的接種量接種黑曲霉，分別在pH值為3.2、3.7、4.2、4.7、5.2、5.7的情況下進行檸檬酸發酵，發酵72 h，每組試驗做兩組平行試驗，測定最后的產酸然后求其平均值，從而確定該因素對檸檬酸發酵的影響。

2.3 檢測方法

(1)檸檬酸測定方法：(粗測法)采用 0.1000 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定。

(2)pH 值測定：精密 pH 試紙測定。

(3)還原糖測定：還原糖測定儀法[5]。

(4)總糖測定：快速測定法[6]。

(5)糖酸轉化率計算公式如下[7]:

式中：C-最終檸檬酸酸度(g/100 mL)；

A-發酵液起糖濃度(g/100 mL)；

B-發酵結束糖濃度(g/100 mL)。

(6)產酸速率計算公式如下：

式中：C1-發酵最高酸度(g/100 mL)；

C2-發酵起始酸度(g/100 mL)；

T-總發酵時間(h)。

3 結果與討論

3.1 初糖對產酸的影響

發酵液初糖濃度的高低直接影響到黑曲霉菌體的生長與發育，而檸檬酸的黑曲霉菌體的生長與發育影響了檸檬酸的產率及糖酸轉化率，所以發酵液初糖濃度的高低是檸檬酸產率和糖酸轉化率的一個重要影響因素。從黑曲霉發酵檸檬酸過程來看，初糖濃度過高會對孢子的生長發育起著抑制的作用；過低又會使菌絲球過于太大，且其形狀也不規則。

表1 發酵液初糖含量對產酸的影響

從表1可以看出，黑曲霉在發酵液初糖濃度低于18 g/100 mL時，糖酸轉化率就一直保持在 90%以上；黑曲霉在發酵液初糖濃度高于18 g/100 mL時，隨著其濃度的升高，糖轉化率不斷降低。同時，可以看出黑曲霉在發酵液初糖濃度高于或低于18 g/100 mL時，其產酸速率及檸檬酸濃度都會一直降低。因為發酵液初糖濃度在18 g/100 mL時，其產酸率及檸檬酸濃度最高，殘糖濃度只有3.47 g/100 mL，糖轉化率也高達91.12%，所以從各方面綜合考慮，選擇發酵液初糖濃度在18 g/100 mL時最為合適。

3.2 接種量對檸檬酸產量的影響

檸檬酸發酵的接種量，直接影響著檸檬酸發酵的產酸量。如果發酵接種的菌絲球太多，就會使菌絲球的形狀不規則，導致發酵液濃度過大，影響溶氧量使產率下降；而發酵接種的菌絲球太少，就會使發酵過程中發酵的效率不夠，從而影響糖酸的轉化率[8]。所以尋找出最佳菌絲球接種量是研究檸檬酸產量的一個重要課題。菌絲球接種量對檸檬酸發酵產酸的影響。

圖1 接種量對檸檬酸產量的影響

由圖1可見，黑曲霉發酵檸檬酸時，最開始時產酸量會隨著黑曲霉的接種量增加而增加，但是如果黑曲霉的接種量超過 10%，則產酸量反而會隨著黑曲霉的接種量增加而降低。所以在實驗中控制發酵接種量在10%左右，即可以達到最佳的發酵結果。

3.3 溫度對產酸率的影響

由于糖化酶的活性直接影響了產物的積累，而溫度對酶的活性影響很大，所以合適的溫度對檸檬酸的產酸量十分重要。對于糖化酶及大多數酶來說，溫度越高，則酶的活性越好，但酶又是蛋白質，會隨著溫度的升高而逐步變性，所以說溫度對糖化酶的影響會存在一個最適溫度。同樣，在檸檬酸發酵過程中，如果發酵溫度過低則糖化酶的活性低，則會使菌體生長緩慢難以完成對原料的轉化；但是發酵的溫度太高，就容易引起菌體老化過快導致發酵后勁不足。

圖2 發酵溫度對檸檬酸產量的影響

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，檸檬酸的產量一直升高，但是在溫度升到35℃左右時，雖然檸檬酸的含量仍會上升，但其上升趨勢大幅度減小。所以綜合能源利用率等方面的考慮，黑曲霉的發酵溫度應控制在(35±1)℃為宜。

3.4 pH值對檸檬酸產量的影響

檸檬酸深層發酵過程中pH值高低直接影響著生產菌(黑曲霉)的代謝活動以及檸檬酸的合成，同時在發酵過程中各種酶促反應也需要在適宜的pH值下進行，因此發酵液的pH值變化是發酵過程中一個重要的控制指標[9]。

3.4.1 發酵液初始pH值對檸檬酸發酵的影響

對于發酵工藝來說，調節合適的發酵初始pH值是十分重要的。特別是像檸檬酸發酵這種以淀粉作為發酵原料的發酵，發酵液初始pH值的高低會直接影響到菌體糖化酶的活力[10]。初始pH值過低，會直接導致糖化酶活性低，使淀粉不能完全水解。反之如果發酵液初始pH值過高，就會使發酵過程中草酸和葡萄糖酸大量積累，使發酵液中雜酸含量過高。不同發酵液初始pH值對檸檬酸發酵產量的影響，見圖 3。

圖3 發酵液初始pH值對檸檬酸產量的影響

由圖3可以看出，當pH值為4.6時，黑曲霉在進行檸檬酸發酵時的產酸率最高。發酵液初始pH值調節過高或者過低，都會使產酸率變低。由此可知糖化酶活性的最佳pH值為4.6。如果發酵液初始pH值過低，則會低于糖化酶最適作用范圍，會使得發酵原料得不到充分利用，進而影響最終產酸率。反之如果發酵液初始pH值過高，則黑曲霉菌絲球會出現老化現象，提前進入衰老期，甚至還會引起菌體自溶。所以，發酵液初始最適 pH 值為4.6。

3.4.2 檸檬酸發酵過程中pH值的變化

黑曲霉的生長以及在發酵過程中的不同階段都需要不同的酸度條件，培養基中堿性物質的消耗和酸性物質的生成自然會引起發酵液pH值的下降，而酸性物質的消耗和堿性物質的生成又可引起pH值的上升。同時其他發酵條件的改變、菌體的自 溶以及雜菌污染也將引起發酵液pH值的變化[11]。因此，在發酵前期保持培養基的pH值穩定，使pH值保持在4～5之間。當pH值過低時，可以適當加入氨水提高pH值；當pH值過高時，可以適當加入硫酸銨降低pH值。

4 結論

通過平行試驗比較不同發酵液初糖濃度對檸檬酸產酸的影響，得出黑曲霉在發酵初糖濃度18 g/100 mL的發酵培養基中進行批量發酵產酸效果最佳。通過平行試驗確定發酵最佳初始pH值為4.6，最佳接種量在10%左右，最佳發酵溫度(35±1)℃

參考文獻

[1]胡愷夫，趙 偉，張理珉.黑曲霉檸檬酸菌種最優發酵條件探究[J].實驗科學與技術,2009,7(6):147-149.

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[9]陳西偉.pH值對檸檬酸深層發酵的影響[J].現代農業科技，2009(5):11-15.

[10]孫 榮.檸檬酸新型清液發酵工藝研究[D].濟南:山東輕工業學院,2011.

[11]陳西偉.pH值對檸檬酸深層發酵的影響與調節控制探討[J].現代農業科技,2009(5):11-15.