玉米葉片葉綠素含量的全基因組關聯性分析

滕守振汪海梁海生辛紅佳李圣彥郎志宏

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

玉米葉片葉綠素含量的全基因組關聯性分析

滕守振1，2汪海2梁海生1，2辛紅佳2李圣彥2郎志宏2

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

植物葉片的葉綠素含量與葉片的光合作用效率和產量潛力緊密相關，因此是作物的一個重要生理指標。但是，目前已克隆的控制葉綠素含量的基因大多來自擬南芥和水稻，尚不清楚玉米自然群體中哪些基因控制葉片葉綠素含量的變異。本研究發現玉米苗期第一片葉片的葉綠素含量和吐絲期穗位葉的葉綠素含量高度相關，且與后者相比具有更高的遺傳力。進一步分析了287份玉米自交系的第一片葉的葉綠素含量，利用558 269個單核苷酸多態性分子標記進行全基因組關聯性分析，獲得9個顯著關聯SNP位點和16個候選基因。通過候選基因的序列分析和功能預測，發現兩個可能和葉綠素含量相關的基因，包括擬南芥Tic22基因的同源基因和水稻衰老相關基因SAG12的同源基因。

玉米；葉綠素值；GWAS

玉米（Zea mays）是當今世界最重要的糧食作物之一，主要應用于食品，飼料和工業生產。玉米的自然群體具有豐富的表型變異和基因型變異，這就為研究玉米基因型與表型的多樣性關系提供了極大的便利［1］。確定控制重要農藝性狀的自然等位變異，不僅有助于解析重要農藝性狀的遺傳基礎，而且可以為分子標記輔助育種提供有效的基因資源和分子標記［2］，因此具有重要的理論意義和應用價值。近年來，關聯分析成為解析復雜數量性狀遺傳基礎的一個重要手段［3］。關聯分析以自然群體為材料，以連鎖不平衡為基礎［4］，將目標性狀的遺傳變異與遺傳多態性相結合，可直接鑒定出與表型變異相關的基因［5］。

葉綠素是綠色植物進行光合作用的基礎物質，是植物葉片的主要光合色素，是研究玉米生長特性、生理變化的重要指標［6，7］。高等植物包含兩種類型的葉綠素，即葉綠素a和葉綠素b。葉綠素a存在于反應中心復合體上，但是葉綠素b僅存在于天線復合體上，主要起保護聚光葉綠素結合蛋白的作用。另外，葉綠素及其派生物對光極其敏感，在光照下很容易產生氧自由基，所以植物生長期間需要精確地調節葉綠素的代謝［8］。目前已經克隆的控制葉綠素含量的基因大部分來自水稻和擬南芥。已有文獻報道，與低產水稻相比，高產水稻擁有更高的葉綠素含量和光合作用速率［9］。在水稻（Oryza sativa）中，Gc基因過量表達時，葉綠素b和葉綠素的含量分別上升了100%和25%［10］，其上位基因DE1的突變會導致該表型更加明顯［11］。過表達植物磺肽素基因（OSpsk3）的轉基因水稻比野生型的葉綠素含量提高了2.3倍［12］。近期有研究表明，Ghd7基因通過下調葉綠素合成基因降低了葉綠素的含量［13］。在擬南芥中，MYC2/3/4和ANAC019/055/072可以通過直接上調葉綠素分解代謝基因來降低葉綠素含量［14］；NAP-AAO3［15］和 ABF1、ABF2、ABF3［16］可以通過調節ABA的方式間接調節葉綠素的含量；而STAY-GREEN1基因則通過與代謝酶結合的方式緩解葉綠素的降解［17］；vpp1 基因產物則通過抵制氧自由基的方式，保護葉綠體膜，從而阻止葉綠素的進一步降解［18］。此外，一些基因通過調節衰老間接控制葉綠素的含量。在煙草和番茄中，異戊烯轉移酶基因（ipt）的過量表達會提高細胞分裂素的含量，延緩衰老以及衰老期間葉綠素的降解［19］；小麥（Triticum aestivum）Tackx4基因編碼細胞分裂素氧化酶，Tackx4基因的過表達會降低細胞分裂素的含量并加速衰老，從而加劇葉綠素的降解［20］。由此可見，葉綠素含量是大量基因和多種機制相互作用的共同結果。

在玉米中已有研究表明葉片的葉綠素含量是決定玉米的光合作用效率以及產量的重要因素［21，22］。本研究測量了溫室條件下三葉期自交系玉米第一片葉子的葉綠素含量，也測量了田間生長的自交系玉米在成熟期穗位葉的葉綠素含量，發現二者有正相關的關系，且前者的遺傳力更高。因此，本研究進一步以 287 份玉米自交系為材料，使用SPAD-502 plus來測量玉米第一片葉子的葉綠素值，通過全基因組關聯性分析，解析與玉米葉片葉綠素含量顯著相關的單核苷酸多態性分子標記位點，并對候選基因進行分析和功能預測，旨在為發掘控制葉綠素含量的自然變異提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

287份玉米自然群體來自嚴建兵教授實驗室；SPAD-502 plus購自柯尼卡美能達公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米的種植 共使用287份自交系玉米，每個自交系種植15棵，每5棵玉米種在一個小盆里。種植深度為3 cm，然后在上面覆上一層與花盆等高的營養土，插上標簽牌，放入托盤中，待種植完成后統一澆水。

1.2.2 玉米的培養 玉米的生長條件為：28℃，16/8 h光照/黑暗，光照強度為100-150 mEm-2S-1，濕度40%-60%。

1.2.3 玉米葉綠素的測量 對于生長至第3片葉與第2片葉等長的玉米幼苗，取下其第一片葉，使用儀器SPAD-502 plus測量第一片葉子的中部。對于田間生長的玉米自交系，在玉米植株開始吐絲當天，測量穗位葉的中部。對每片葉子測量5-10個數據，取平均值記為該葉子的葉綠素值。

1.2.4 數據處理 利用R軟件（版本號3.3.1）計算出每個自交系葉綠素的平均值，使用Tassel 5（版本號5.2.31）的混合線性模型［23］，進行葉綠素含量與單核苷酸多態性標記位點的關聯分析。Pearson相關系數的計算和正態分布檢驗分別采用R語言stats軟件包的cor函數和shapiro.test函數（https://www. r-project.org/）。

2 結果

2.1 玉米苗期第一片葉與吐絲期穗位葉葉綠素含量的相關性分析和遺傳力分析

本研究首先測量了103份自交系玉米三葉期第一片葉的葉綠素含量，以及相同玉米材料田間種植條件下吐絲期穗位葉的葉綠素含量，并對兩個性狀進行相關性分析和遺傳力分析。如圖1所示，第一片葉和穗位葉的葉綠素含量具有明顯的線性關系，且相關性較高（Pearson相關系數r=0.74）。此外，如表1所示，與穗位葉的葉綠素含量相比，第一片葉的葉綠素含量具有更高的遺傳力。這說明在溫室條件下，玉米第一片葉的葉綠素含量比田間條件下穗位葉的葉綠素含量受環境影響更小。由于全基因組關聯分析需要精確測量高遺傳力的表型，因此本研究進一步對玉米第一片葉的葉綠素含量進行分析。

圖1 第一片葉子與穗位葉葉綠素含量的相關性分析

表1 第一片葉子與穗位葉葉綠素含量的遺傳力分析

2.2 玉米第一片葉的葉綠素含量在自然群體中的多樣性

玉米的葉綠素含量容易受到環境的影響，所以本次實驗是在可控的溫室中進行。本研究共測量了287份自交系玉米的葉綠素含量，結果（圖2）表明葉綠素含量值符合正態分布，適合作全基因組關聯分析。在這些自交系中，5個葉綠素值最低的自交系是BT1、CIMBL37、CML282、CIMBL117和By4944。5個葉綠素值最高的自交系是RO8、CIMBL137、GEMS64、GEMS52和GEMS44。這些自交系可以用來進一步研究第一片葉葉綠素值的生理效應，也可以作為親本構建群體，進一步開發分子育種所需的標記。這287份自交系可以分為TST、NSS、SS和混合型群體，分析各個亞群體的葉綠素值發現，SS玉米第一片葉子的葉綠素值平均比NSS高，而NSS玉米的葉綠素值平均比TST高。

圖2 不同亞群自然群體的葉綠素值

2.3 玉米第一片葉葉綠素含量的全基因組關聯分析

使用混合線性模型進行全基因組關聯分析。如表2和圖3所示，具有統計學顯著意義的SNP標記位點有9個（P≤9.09×10-8，P＜ 0.05/n，n=使用的標記總數），其中有5個SNP位點表現為極其顯著（P≤1.82×10-8，P＜ 0.01/n）。這些SNP位點大部分分布在10號染色體上，在3號和5號染色體上也有分布。

以B73基因組序列為參考，在顯著關聯位點上下游6E4 bp尋找候選基因，最終得到16個候選基因。對這16個候選基因進行同源分析和功能注釋，結果如表3所示。

表2 和葉綠素含量顯著相關的SNP位點

圖3 葉綠素含量全基因組關聯分析的曼哈頓圖

表3 16個候選基因的基本信息

在這些候選基因中，GRMZM2G097959編碼Tic22蛋白。在擬南芥中Tic22蛋白具有將葉綠體蛋白從葉綠體間隙輸入到葉綠體基質的功能［24］，該蛋白基因的敲除會導致擬南芥的葉綠體變小，而且突變體葉綠素含量僅為野生型葉綠素含量的一半［25］。GRMZM2G363926編碼一個半胱氨酸蛋白酶。在水稻中，該基因的同源基因SAG12負調控細胞的程序性死亡，SAG12基因的突變導致水稻受到環境脅迫時，細胞死亡率顯著升高［26］。這兩個候選基因和顯著關聯SNP在基因組上的相對位置如圖4所示。GRMZM2G097959位于chr3.S_2451902上游1kb處，GRMZM2G363926在chr10.S_100431934、chr10.S_100431952、chr10.S_100431969、chr10.S_100432171下游約50 kb處。

圖4 候選基因GRMZM2G097959和GRMZM2G363926與顯著關聯SNP在基因組上的相對位置

3 討論

已有研究表明，玉米葉片的葉綠素含量是葉片光合作用速率的一個重要決定因素。在本研究中，利用287份玉米自交系分析了玉米自然群體中葉綠素含量，發現葉綠素含量在玉米自然群體中具有高度的多態性。本研究獲得了9個和葉綠素含量顯著關聯的SNP位點，以及16個候選基因，但是這些基因的功能目前尚不清楚。功能注釋表明這些候選基因中至少有兩個基因可能控制著葉綠素含量。

一個候選基因是GRMZM2G097959。GRMZM2-G097959在擬南芥中的同源基因編碼Tic22蛋白，該蛋白位于葉綠體內膜上［24］，主要在早期生長階段表達，具有將葉綠體蛋白從葉綠體間隙輸入到葉綠體基質的功能。該基因的敲除導致擬南芥在早期生長階段葉片的變化非常明顯，主要表現為葉綠體變小，而且葉綠素含量僅為野生型葉綠素含量的50%。但是隨著生長時間的延長，突變體與野生型的葉綠素含量趨于一致［25］。我們推測玉米的GRMZM2G097959基因可能在玉米中也具有相同或相似的生化和生理功能。另一個候選基因是GRMZM2G363926。該基因在擬南芥中的同源基因是衰老相關基因12（SAG12），編碼木瓜蛋白酶型的半胱氨酸蛋白酶，該基因只在衰老過程中誘導表達，但是它的突變并沒有影響到擬南芥的表型［27］。但是在水稻中的研究發現，水稻SAG12基因的突變并不會影響正常條件下生長的水稻，當水稻受到環境脅迫時，該基因突變會導致水稻細胞死亡率顯著升高。因此，水稻SAG12基因在脅迫條件下負調控細胞程序性死亡［26］。在下一步研究中，可以利用具有不同單倍型候選基因的玉米品種構建雙親群體，通過連鎖分析驗證關聯分析的結果，并利用基因敲除等技術手段驗證候選基因的功能。

4 結論

本研究通過全基因組關聯分析，解析了玉米第一片葉葉綠素含量的遺傳結構。獲得9個與葉綠素含量顯著關聯的SNP位點以及16個候選基因。對候選基因的序列分析和功能預測表明其中至少有兩個基因可能控制著玉米自然群體葉綠素含量的變異。

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（責任編輯 李楠）

Genome-wide Association Study of Chlorophyll Content in Maize Leaves

TENG Shou-zhen1，2WANG Hai2LIANG Hai-sheng1，2XIN Hong-jia2LI Sheng-yan2LANG Zhi-hong2
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest Science and Technology University，Mianyang 621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

The chlorophyll content of plant leaves is closely related to photosynthetic efficiency and yield potential，thus it is an important physiological indicator of all crop species. However，currently most cloned genes controlling chlorophyll content are from Arabidopsis and rice，and the genetic basis of natural variation in chlorophyll content in maize is still unclear. In this research it was discovered that the chlorophyll content of the first leaves at the seedling stage was highly correlated with that of ear leaves at silking stage，and the former had a higher heritability than the latter. This study further analyzed the chlorophyll contents of first leaves from 287 maize inbred lines. Genome-wide association study using 558 269 SNP markers revealed 9 SNPs significantly associated with the measured trait，leading to the discovery of 16 candidate genes. Two genes potentially controlling chlorophyll content in maize were identified by sequence analysis and functional annotation of these candidate genes：a homolog of the Arabidopsis Tic22 and a homolog of rice SAG12 relating to aging.

maize；chlorophyll content；GWAS

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.013

2016-12-07

國家自然科學基金項目（31501325），國家重點研發計劃（2016YFD0100405）

滕守振，男，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：tengshouzhen_91@sina.cn

郎志宏，女，研究員，研究方向：玉米功能基因組學；E-mail：langzhihong@caas.cn