重組毒素rCCK96-104PE38 靶向結腸癌生物特性研究

張嵩柳溪林李萌常江高世奇胡盼柳增善

（1. 吉林大學動物醫學學院 人獸共患病研究所教育部重點實驗室，長春 130062；2. 吉林大學中日聯誼醫院，長春 130033）

重組毒素rCCK96-104PE38 靶向結腸癌生物特性研究

張嵩1柳溪林2李萌1常江1高世奇1胡盼1柳增善1

（1. 吉林大學動物醫學學院 人獸共患病研究所教育部重點實驗室，長春 130062；2. 吉林大學中日聯誼醫院，長春 130033）

旨在原核表達并純化新型重組毒素rCCK96-104PE38，驗證其對結腸癌細胞的靶向殺傷作用。使用基因擴增技術將反向編譯的膽囊收縮素CCK96-104與綠膿桿菌外毒素PE38融合，構建原核表達載體。利用Ni-NTA親和層析進行純化。通過結腸癌細胞體外殺傷實驗以及結腸癌裸鼠模型的治療驗證rCCK96-104PE38的抗腫瘤能力。結果顯示，擴增出的rCCK96-104PE38序列正確，成功利用pET-28a原核表達系統實現了活性表達。純化后的重組蛋白能夠在體外誘導結腸癌細胞凋亡，并能抑制裸鼠模型體內的腫瘤生長。成功制備高純度、無標簽的rCCK96-104PE38重組免疫毒素，體內、體外實驗證實其具有抑制結腸癌的能力。

重組毒素；結腸癌；膽囊收縮素；綠膿桿菌外毒素

結腸癌是人類高發惡性腫瘤之一，其發病率一直呈上升趨勢，全球每年患結腸癌的病例超過100萬人［1］。目前，結腸癌的治療手段以手術治療為主，輔以化療、放療等治療手段，針對結腸癌的常用抗腫瘤藥物包括5-Fu（5-氟尿嘧啶）、伊立替康、奧沙利鉑、卡培他濱等［2］，但術后腫瘤易復發，且副作用不容忽視。近年來，基因治療藥物、免疫治療藥物等靶向治療藥物得到了快速發展［3］，為結腸癌的治療開辟了新途徑。

分子靶向治療是以腫瘤細胞過度表達的分子作為靶位，選擇針對性的阻斷劑，能夠作用于腫瘤細胞生長、運動等的信號傳導通路或誘導免疫因子識別并消滅腫瘤細胞等途徑，從而使腫瘤細胞生長變慢或者發展停止［4，5］。研究發現，在胃腸道腫瘤發生發展的過程中，膽囊收縮素2型受體（CCK2R）在腫瘤細胞中的表達顯著高于正常細胞，在部分結腸癌、大腸癌、胃癌細胞系中的過表達更加突出［6-9］，是結直腸癌診斷和治療的理想靶點。

本研究根據結腸癌與正常組織表面CCK2R數量與親和力的巨大差異，利用基因工程技術構建新型重組毒素rCCK96-104PE38，即截取全長CCK的第96-104號氨基酸，反向重組后作為導向單元與具有高效細胞毒性的PE38（綠膿桿菌外毒素）結合，獲得可以靶向高效殺傷結腸癌細胞的分子藥物，并通過結腸癌體內體外實驗探索其靶向特性，為臨床前試驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、限制性內切酶Nhe I和BamH I、低分子量蛋白Marker、DL2000核酸Marker、pMD-18T Kit、T4連接酶均購自日本TaKaRa公司；膠回收Kit、質粒小提Kit購自美國Axygen公司；卡那霉素、氨芐青霉素、IPTG購自北京鼎國公司；Ni-NTA親和層析介質、Tricorn 10/150玻璃柱購自瑞典GE公司；rTEV酶購自北京索萊寶公司；胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；熒光染料Dylight 488，HRP標記羊抗鼠IgG抗體購自上海艾博抗公司；PE38單克隆抗體3B9為本實驗室制備；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.2 質粒、菌株、細胞、裸鼠 pET-28a質粒購自德國Novagen公司；pET-rG17PE38重組質粒、感受態BL21（DE3）PLysS、感受態DH5α、人肝細胞LO2、大腸癌細胞系SW116、結腸癌細胞系HCT8、SW620、SW480均為本實驗室保存，裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 rCCK96-104PE38原核表達菌株的構建

1.2.1.1 引物 以本實驗室構建并保存到pET-rG17PE38為模板，利用PCR方法將反向的CCK96-104片段基因與PE38基因進行融合，并引入了rTEV酶特異性切割位點，人工合成引物為：其中，下劃線分別為Nhe I和BamH I酶切位點。

1.2.1.2 原核表達載體的構建 將PCR產物與pET-28a質粒分別進行雙酶切，然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切效果，并使用膠回收試劑盒回收目的基因和載體片段，使用T4連接酶水浴16℃過夜連接，連接產物轉化到BL21（DE3）PLysS感受態細胞中。

1.2.2 重組毒素 rCCK96-104PE38的表達與鑒定

1.2.2.1 低溫誘導表達 將重組菌按1∶100的比例接入LB培養基（Kana 50 ng/mL）中，于37℃ 7，1.5 h后，將培養箱溫度降至16℃ 6將培養箱溫度IPTG至終濃度0.1 mmol/L，搖培18 h。

1.2.2.2 Western blot 鑒定 將表達的rCCK96-104PE38重組蛋白進行 SDS-PAGE凝膠電泳，再通過電轉儀轉移到PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜后，先后加入PE38的單克隆抗體3B9（本實驗室制備），和HRP標記羊抗鼠IgG二抗。最后加入ECL化學發光顯色液顯色呈像。

1.2.3 重組毒素 rCCK96-104PE38的純化

1.2.3.1 Ni-NTA親和層析 使用?KTA蛋白純化儀進行純化。首先用5-10個柱體積的Ni-NTA親和層析平衡緩沖液Buffer A（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，10%甘油，pH7.0）充分平衡Ni-NTA親和層析柱；將超聲上清注入緩慢注入層析柱，再用洗脫緩沖液Buffer B（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，10%甘油，pH7.0）調節混合液咪唑濃度按梯度洗脫下目的蛋白。

1.2.3.2 rTEV酶切除組氨酸標簽 加入rTEV酶對組氨酸標簽切割，再通過Ni-NTA親和層析獲得切割標簽后的目的蛋白。

1.2.4 重組毒素rCCK96-104PE38體外抑瘤實驗

1.2.4.1 rCCK96-104PE38體外腫瘤細胞殺傷活性檢測 將對數生長期的HCT116細胞以及人肝細胞LO2分別經胰酶消化后，以5×103個細胞/孔鋪在96孔細胞培養板中，待細胞貼壁后加入終濃度為2 000 ng/mL的rCCK96-104PE38，用CCK-8試劑盒測定不同時間點重組毒素對腫瘤細胞的抑制率。

1.2.4.2 受體免疫熒光檢測 在培養好的HCT116細胞中加入4%多聚甲醛固定30 min；5%胎牛血清封閉30 min；加入終濃度為2 000 ng/mL rCCK96-104PE38KDEL重組蛋白，37℃孵育10 min，再先后孵育PE38單抗和熒光二抗，通過熒光顯微鏡觀察。

1.2.4.3 腫瘤抑制率測定 在對數生長期的人正常肝細胞、結腸癌細胞系HCT116、HCT8、SW620、胃癌細胞系BGC823、黑色素瘤B16、宮頸癌細胞系HeLa中，加入不同濃度的rCCK96-104PE38重組蛋白，孵育48 h后，使用CCK-8試劑盒測定腫瘤抑制率及IC50值。

1.2.5 重組毒素rCCK96-104PE38動物體內抑瘤實驗

1.2.5.1 免疫缺陷鼠腫瘤模型的建立 取1×107個HCT116細胞溶于200 μL生理鹽水中，用注射器注入裸鼠右前肢腋下。7 d后觀察小鼠注射部位是否出現腫塊。

1.2.5.2 rCCK96-104PE38治療腫瘤模型 選取腫瘤體積達到50-100 mm3的腫瘤模型小鼠30只，平均分成6組，G1組：每日每只注射200 μL生理鹽水；G2組：每日每只注射5 mg/kg rCCK96-104PE38；G3組：每日每只注射10 mg/kg rCCK96-104PE38；G4組：每日每只注射20 mg/kg rCCK96-104PE38；G5組：每日每只注射10 mg/kg奧沙利鉑；G6組：每日每只注射10 mg/kg奧沙利鉑和10 mg/kg rCCK96-104PE38。注射方式為尾靜脈注射，連續注射14 d，治療結束后將小鼠處死，記錄瘤重、瘤體積，體重等指標。

2 結果

2.1 rCCK96-104PE38重組毒素的表達與鑒定結果

如圖1所示，經10% SDS-PAGE電泳分析，誘導后的重組菌株在40 kD附近表達重組蛋白，與設計的rCCK96-104PE38大小相符。Western blot結果表明，該重組蛋白能與PE38抗體特異性結合。

圖1 重組蛋白rCCK96-104PE38的SDS-PAGE重組蛋白表達（A）與Western-blot鑒定結果（B）

2.2 Ni-NTA親和層析純化結果

經10% SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果（圖2）顯示，在300-450 mmol/L咪唑濃度下，重組蛋白rCCK96-104PE38被洗脫下來。

圖2 Ni-NTA金屬螯合親和層析純化（梯度洗脫）

2.3 腫瘤抑制曲線

如圖3所示，在培養基中加入rCCK96-104PE38后，結腸癌細胞HCT116迅速凋亡，其致凋亡速率與PE毒素相近，而對人正常肝細胞沒有顯著影響；而PE毒素不僅能殺死腫瘤細胞，也能夠致死正常的肝細胞，顯示出對真核細胞的廣譜殺傷性。

圖3 抑制曲線

2.4 rCCK96-104PE38在靶細胞上的定位

通過間接免疫熒光實驗，發現rCCK96-104PE38重組蛋白能夠特異性的吸附在結腸癌細胞HCT116表面，而在肝細胞LO2上檢測不到強的綠色熒光；PE毒素在HCT116及LO2細胞上均有結合，見圖4。

2.5 rCCK96-104PE38對不同細胞的抑制效果

通過CCK8法測定不同濃度的重組蛋白對不同細胞的抑制率，并使用SPSS統計分析軟件計算獲得相應的IC50值（半抑制濃度）。如表1所示，rCCK96-104PE38對結腸癌細胞系的抑制效果最好，對胃癌細胞BGC823也有一定的作用，而對黑色素瘤B16、宮頸癌HeLa、人肝臟細胞LO2均沒有顯著抑制效果，與預期相符。

圖4 間接免疫熒光檢測rCCK96-104PE38在靶細胞上的定位

表1 rCCK96-104PE38對不同細胞殺傷效果（IC50）

2.6 毒性測試

裸鼠模型在單次注射30 mg/kg時即出現中毒現象，當劑量增加到60 mg/kg時有小鼠出現死亡（表2）。

表2 rCCK96-104PE38的急性毒力測試

2.7 體內抑瘤效果

以不同劑量的重組毒素和常規藥物對結腸癌裸鼠模型進行治療發現，20 mg/kg的rCCK96-104PE38能夠顯著抑制腫瘤的生長，與常規化療藥物奧沙利鉑聯合給藥的抑瘤效果最好，見圖5。

圖5 體內抑瘤效果

3 討論

重組免疫毒素是一種融合了靶向分子和毒素的人造蛋白，根據靶向分子的不同主要分為兩類，一類是融合了靶向某種特異性受體的天然配體，一類是融合的抗體或單鏈抗體［10，11］，本研究的rCCK96-104PE38重組免疫毒素就屬于第一類重組免疫毒素，具有特異性靶向殺傷結腸癌腫瘤細胞的能力。

PE毒素，即綠膿桿菌外毒素，由638個氨基酸構成的一個單鏈多肽，屬于雙組分AB毒素家族［12］。PE毒素的優勢在于，普通人體內沒有PE毒素的預存抗體，而且PE毒素不僅毒性強，而且毒性機理研究已經很清楚，便于進行編輯改造及活性表達［12，13］。通過將PE分子非特異結構域1-252位和365-380位的氨基酸殘基去除，得到了38 kD大小的PE38，具有更低的免疫原性，同時，將PE38羧基端的REDLK突變為KDEL，能夠使細胞毒性提升6-10倍［14，15］。

膽囊收縮素（CCK）是由十二指腸和近端盲腸的I型腸內分泌細胞和大腦神經元合成分泌，其主要生理功能是刺激胰腺分泌、膽囊收縮、抑制胃酸分泌，產生飽腹感等［16］。CCK發揮作用均與CCK2R（膽囊收縮素2型受體）相關，而CCK2R在腫瘤細胞中過表達，因此可以將CCK作為重組免疫毒素特異性識別腫瘤細胞的識別元件［17］。CCK在人體內以多種長短不同的分子形式存在，均為含115個氨基酸的CCK原加工剪切形成的多肽［18］，本研究最終選擇了能發揮CCK2R親和作用的第96-104位的Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly九個氨基酸作為重組毒素的導向元件。

在測定rCCK96-104PE38重組免疫毒素對不同細胞的抑制效果時發現，其對胃癌細胞系BGC823也有明顯的致凋亡作用，原因是CCK2R不僅在結腸癌細胞上高表達，在部分胃癌細胞、部分胰腺癌中也高表達［19-21］，進一步證實了rCCK96-104PE38是通對CCK2R進行定位并發揮細胞毒作用。

4 結論

本實驗室成功構建rCCK96-104PE38的原核表達載體，低溫誘導表達出可溶性重組毒素蛋白，并通過Western blotting驗證。重組蛋白經Ni-NTA親和層析純化。通過體外細胞實驗和結腸癌裸鼠模型體內實驗證實，rCCK96-104PE38具有靶向殺傷結腸癌的功能。

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（責任編輯 馬鑫）

Characterization of Recombinant Toxin rCCK96-104PE38 Targeting Colon Cancer

ZHANG Song1LIU Xi-lin2LI Meng1CHANG Jiang1GAO Shi-qi1HU Pan1LIU Zeng-shan1
（1. Key Laboratory of Zoonosis，Research Ministry of Education，College of Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062；2. China-Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun 130033）

This work aims to conduct the prokaryotic expression and purification of a novel recombinant toxin rCCK96-104PE38，and to verify the targeted killing effect on colon cancer cells. A reversed cholecystokinin（rCCK96-104）was conjunct to pseudomonas exotoxin（PE38）by gene amplified technology to construct a prokaryotic expression vector. Ni-NTA affinity chromatograph was used for purification. The anti-tumor ability of rCCK96-104PE38 was verified by in vitro cytotoxicity of colon cancer cells and vivo experiment with nude mice model. Results showed that the amplified gene of rCCK96-104PE38 was in correct sequence as designed，i.e.，the active expression was successfully achieved using prokaryotic expression system of pET-28a. The purified recombinant protein induced the apoptosis of colon cancer cells in vitro，and inhibited the tumor growth in nude mice model. Conclusively，it was successful to produce the recombinant toxin rCCK96-104PE38 in high purity and with no tags，the vitro and vivo experiments confirmed that it had inhibitory ability on colon cancer.

recombinant toxin；colon cancer；cholecystokinin；pseudomonas exotoxin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.032

2016-12-21

國家青年科學基金項目（81401953），中國博士后科學基金面上項目（2014M561303），中國博士后科學基金特別資助項目（2015T80312），吉林省青年基金項目（20160520162JH），教育部博士點基金項目（20120061110078），吉林省科學技術廳計劃項目（20120966）

張嵩，男，碩士研究生，研究方向：動物性食品安全；E-mail：442557139@qq.com

柳增善，男，教授，研究方向：動物性食品安全，E-mail：zsliu1959@sohu.com；胡盼，女，講師，研究方向：動物性食品安全，E-mail：hupan84@163.com